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Lexogen公司QuantSeq Expression Profiling Library Prep Kits - 用于表达谱文库构建

活动品牌:Lexogen|文库构建 | 有效期:2017.02.10-2017.03.31
Lexogen公司QuantSeq Expression Profiling Library Prep Kits - 用于表达谱文库构建
QuantSeq Expression Profiling Library Prep Kits


QuantSeq建库试剂盒提供了文库构建的实验方案,可构建适用于Illumina和Ion Torrent系统的、靠近poly(A) RNA 3' 端序列的文库。每个转录物仅生成一个片段,从而准确的实现了基因表达的量化,同时节省了测序空间并实现了高度的多重性(saving on sequencing space and allowing for a high level of multiplexing)。


优势:
§ 快速简单的一体化实验方案: 从总RNA到可用于测序的文库不到4-5小时
§ 每条转录物仅有一个片段产生 — 精确的基因表达定量化
§ 对于Illumina和Ion Torrent操作平台,高度的多重性是可能实现的,且不遗失信息
§ 转录物长度无需标准化,降低了数据处理的复杂性
§ 适用于低投入量(100 pg total RNA)和低质量(包括FFPE样本) RNA
§ 可以在大多数移液器(liquid handlers)上轻松实现自动化 (autoQuantSeq)
针对目标RNA测序(targeted RNA-Seq)的定制引物可以在QuantSeq-Flex系统中使用


工作流程

QuantSeq 3'mRNA-Seq实验方案在反转录过程中通过oligo dT引物筛选出poly(A)尾。第二链的合成是由随机引物启动,由于插入片段的大小是由第二链合成引物和poly(A)尾之间的距离决定的,因此无需额外进行 RNA 片段化。
QuantSeq的链特异性异常高,高达99.9 %。降低的实验噪音保证了反义转录的准确检测和量化。更重要的是,每个转录物只产生一个片段。
使用QuantSeq-Flex Targeted RNA-Seq试剂盒,可以产生4种不同的文库类型,其类型取决于引物的不同组合。反转录反应可以由oligo dT引物(包含在试剂盒中)或标靶特异性引物引发,第二链的合成可以由随机引物(包含在试剂盒中)或标靶特异性引物启动。


图 1 | QuantSeq 3' mRNA-Seq建库试剂盒(左侧)和Quant-Seq-Flex建库试剂盒(右侧) 工作流程图。QuantSeq FWD试剂盒(Cat No. 015)的Read 1反映了靠近3'端的mRNA序列,实现了Illumina标准测序引物的经济的二代测序。在QuantSeq REV试剂盒中(Cat. No. 016),Read 1和Read 2的接头(adapter)位置互换,从而实现了Read 1的转录终点的精确测定。QuantSeq REV试剂盒(Cat. No 016) Read 1的测序需要定制的测序引物(CSP, 包含在试剂盒中)。

性能:
3' 端链特异性作图
FDA测序质控 (SEQC) 标准样品A和B,是分别被ERCC外源RNA对照ExFold混合物1和混合物2跟踪标定的参照RNA。QuantSeq文库由这些样本制备而成,并与近期Association of Biomolecular Resource Facilities (ABRF) 发布的NGS 研究中的mRNA-Seq数据组比对。在标准mRNA-Seq中,测序读取值(Reads)分布在转录物全长中,而QuantSeq的读取值(Reads)仅覆盖3'端 (图1)。在该例中,QuantSeq在精确的测量了基因表达水平的同时,节省了大于90%的测序深度。
由于跟踪标定(spike-in)转录物仅存在于正向转录中,链特异性的评估可以不依赖于于任何基因组标注。QuantSeq在各种情况下均显示出高于99.9%的strandedness,而两个被评估的mRNA-Seq SEQC数据集(data sets)仅分别为93.4%和97.8%。


转录物百分率(5' to 3')
图2 | QuantSeq和标准mRNA-seq的覆盖度与标准化转录物长度的对照。RSeQC-衍生的覆盖度分别被标注为所有转录物(面积),ERCC 混合物(线性),QuantSeq (彩色)和mRNA-Seq (灰色)。曲线面积值(AUC)作为测序覆盖度的测量尺度。

QuantSeq横跨6个数量级的成比例量化
为了分析QuantSeq的基因计算准确性,ERCC 跟踪标定转录物的读取计数被绘制为分子进行输入(图3)。在线性模型评估和Spearman关联性评估中,QuantSeq展现出了相当高的输入-输出关联性和基因表达测定的准确性。


# 分子
图 3 | QuantSeq-起源的ERCC读取数与记录输入间存在极好的关联性。

差异性基因表达
通过使用"erccdash- board" 软件,对QuantSeq和mRNA-Seq的差异性基因表达的检测能力进行了对比。当测定的读数(Reads)由10M降低到0.625M,QuantSeq维持了相当高的曲线面积值(AUC 0.860-0.897),而mRNA-Seq的曲线面积值较低,在0.736到0.776之间 (图 4)。

假阳性率 (FPR)
图 4 | QuantSeq和mRNA-Seq差异性基因表达。预定的ERCC ExFold跟踪标定混合液1和混合液2间的倍数变化(4:1,1:1.5,1:2)用于评估真假阳性率(TPRs and FPRs)。最优的差异性基因表达检测体现在最大值为1的曲线面积(AUC)。当测定的序列从10 M到0.625 M降低取样时,需要将曲线面积值与检测的ERCC RNA的数量(#ERCC)一起进行评估。
参考文献
1. The External RNA Controls Consortium (2005) The External RNA Controls Consortium: a progress report Nature Methods 2:731-734 2. Ambion ERCC RNA Spike-In Control Mixes Cat No 4456740, 4456739
3. Li, S et al (2014) Multi-platform assessment of transcriptome pro ling using RNA-seq in the ABRF next-generation sequencing study Nat. Biotechnol. 32, 915–925
4. Munro, S A et al (2014) Assessing technical performance in differential gene expression experiments with external spike-in RNA control ratio mixtures Nat. Commun. 5, 5125

订购信息:

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  Expression Profiling Library Prep Kits
  3' mRNA-Seq Library Prep Kits
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QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit (FWD), 24 preps
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QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit (FWD), 2 x 96 preps
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QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit (REV) with Custom Sequencing Primer, 96 preps
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QuantSeq 3' mRNA-Seq Library Prep Kit (REV) with Custom Sequencing Primer, 2 x 96 preps
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QuantSeq-Flex Targeted mRNA-Seq Library Prep Kit with First and Second Strand Synthesis Modules, 24 preps
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