实验常见问题解答汇集

  • 来源:上海锐赛生物技术有限公司
  • 时间: 2012/11/21
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    实验常见问题解答汇集(一)

     


    BSP甲基化扩增得到的PCR产物可否直接测序,为什么需要构建TA克隆后测序?

    由于基因组DNA的每个CG位点甲基化程度各不相同,未发生甲基化的C会被重亚硫酸盐修饰成为U,而C若发生甲基化则不变,这样如果进行PCR产物测序就有可能在原有的C位点得到双峰图,无法确定甲基化的程度,必需通过回收PCR产物,进行TA克隆,随机挑选5-10个单克隆测序的方式才能计算获得每个CG位点的甲基化情况。

    如何提高哺乳动物细胞的转染效率?

    对于生物技术科研实验,拟将外源基因(或DNA序列)导入到体外培养的细胞中(尤其是各类哺乳动物细胞),让外源基因在细胞中进行表达甚至翻译,到达预期目的,那么除了保障携带基因的质粒载体上具备高表达元件(启动子、增强子、终止子等)之外,另外一个重要因素是让外源基因的转染效率达到极高值,尤其对于基因干扰研究实验而言,达到80%以上的转染效率,是干扰评价实验顺利完成的前提保证。

    关于如何提高转染效率,以下是锐赛团队实践一些心得,系统整理如下

    1、细胞本身的状态的重要性占着70%以上的比重。那么细胞生长状态体现哪些方面
    1)细胞周期:分裂期细胞往往要比静止细胞更易于摄取并表达外源DNA。因此,细胞都在转染当天或前一天铺板。同样重要的是细胞在种板进行转染时不应处于过度生长的状态;此外对于原代细胞,还常用促有丝分裂刺激物(如病毒转化,生长因子,条件培养基等)来活化。所以要观察293系列细胞在铺板后多长时间(12h?18h?24h?)到达分裂期,但又不能是过度生长状态!
    2) 细胞融合率(密度数量):只要培养基质(培养皿)尚有空间,细胞就会按指数规律分裂。对于正常细胞而言,细胞生长的速度受细胞密度大小的接触抑制(癌细胞则不受此限制而会继续生长并可互相叠加)。营养的耗竭以及代谢废物的积聚会影响所有的细胞生长,细胞会因为缺乏营养而不适于转染。个人认为一般293系列细胞铺板50%密度,16-20h达70%可以转染,切忌贴壁就转染!
    3) 传代次数:传代次数是指对一个细胞系进行分批传代的频度(通常在一个实验室范围内)。某些细胞系相比较其他细胞系而言较不稳定,可能会随着培养时间的延长而改变,视不同的细胞系和培养条件而定,因此名称相同的同一细胞系在生理学和形态学(以及转染能力)性质也可能会有很大差异;另外分板传代培养时把贴壁细胞用胰蛋白酶消化,这个常规操作可导致正常细胞功能受到严重损害,因此要重视转染前细胞的铺板操作优化(如胰蛋白酶消化时间的长短、胰蛋白酶的灭活等)。教科书上说,细胞在冻存复苏后的一两代之内或直到它们完全复苏之前都很难转染。
    4) 贴壁与悬浮:在转染效率方面贴壁细胞和悬浮细胞之间的差异显著。相对于贴壁细胞(如HEK,CHO),悬浮细胞(如HL 60,Jurkat)非常难以转染,可能是因为细胞间膜结构的差异,但目前还没有分子水平上合理机制的解释。
    2、质粒载体DNA的质量也是转染好坏的重要因素
    1)一般原则:对纯化所得的载体进行质量鉴定,在转让时一定要选用一种已知具有功能的载体做对照。
    2)载体的完整性:书面报告中核实载体元件(启动子/增强子/ORI等等)。
    3) 载体的制备质量:纯化质量情况,是否有其他载体交叉污染,制备产物中残余的污染物(如氯仿、酒精、CsCl、内毒素)可能会影响转染效率。
    3、培养条件影响细胞转染实验的成败
    1) DNA-转染试剂复合物:转染操作中复合物稀释液的PH值变化很重要(个人经验:某次转染一批细胞中,有一孔的稀释液与其他的不是同一管,结果感觉此孔的荧光比其他较强。 但是要得出结论需要反复验证,排除细胞状态差异,随机差异)。注意观察培养基颜色。
    2) 培养基的“新鲜”:保证培养基的新鲜,忌讳转染实验时更换培养基体系,尽量减少试剂或添加剂的变更。
    3 )营养的保证:血清、二氧化碳浓度稍微变化,会对结果有很大影响。
    4 )杜绝有任何可能性污染时进行转染实验:化学物质、细菌、真菌的污染,还有细胞与细胞的交叉污染。
     
     
     
     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     


    用同样一个病毒载体系统进行病毒包装实验,为什么有人做的很好,次次成功,有人却是时常做不出来,稳定性很差,不是滴度低就是根本不出毒?

     

    从我们对不同载体系统病毒包装的多年经验总结,主要以下几个方面心得

    第一,病毒包装的几个关键节点就是细胞因素、载体系统(尽量使用成熟的商业化载体系统)、构建重组的质粒正确与否、质粒抽提纯化情况、包装转染控制(24、48小时的细胞及荧光状态判断)、目的基因对病毒包装影响(基因大小、序列情况、蛋白功能毒性等都会影响到是否能包装成功)。
    第二,如果有细胞培养和细胞转染实验的常规经验,细胞因素应该没有什么问题(细胞培养人员一定要关注,包装或转染感染前一定要重视细胞干净细微污染与否、饱满立体感是否好、铺板均匀细胞密度适中否),细胞产毒出毒期间过程中的活力是包装正常和出来的病毒滴度高低的一个重要环节(正常包装出病毒情况,慢病毒、逆转录病毒包装一个细胞出一个病毒颗粒,腺病毒是1000个,腺相关病毒是10000个),所以实践操作表明,病毒包装转染时细胞的密度要控制,使得收毒(72小时)时细胞密度在90%-95%左右。
    第三,建议使用商品化的成熟毒载体系统(不要用来路不清或基本被淘汰很少人在使用的系统),从文献和我们多年的实践可以结论,这类系统是稳定的,因而分析原因时尽量少花精力在对载体系统的验证上,这样会白花力气。
    第四,至于包装转染时的操作控制细节及其转染试剂因素,只要在操作时按相关使用说明和操作步骤,应该没有大问题,所以也不要白花太多精力在这上面。
    第五,另一个需要重点关注和排查的因素就是目的基因的表达载体构建和抽提纯化环节,是否构建时导致质粒载体重组或某个部件缺失,或污染别的质粒或杂物?中抽纯化是否污染?是否抽提的是别的质粒?要养成同时做阴性对照的习惯(是否目的基因载体和阴性对照GFP载体是同一批,建议同一批,建议每次包装都如此操作),如果这个环节没有啥问题,在构建中出现重组和缺失、或抽提纯化失败的可能性也不大。
    第六,落实了上面那些因素,那就是最后一个原因,目的基因的大小、序列情况、该目的蛋白的功能毒性等导致无法包装成功(实践中,这种情况是有的,我们偶尔会遇到,可能原因是一些基因表达翻译后对包装细胞产生毒性,导致细胞状态异常),那么我们能做的就是换病毒包装载体系统,尝试其他载体系统能否包装出来。不过这种情况出现的几率非常低,你做上100个基因,也可能碰不上一个。
    因而总的来说,我们进行病毒包装实验时要重视包装材料——细胞及表达质粒(对拿过来的细胞和载体系统要验证,常出现包装细胞、空表达载体质粒就有问题,我们要定期纯化生产包装细胞、空表达载体质粒),细胞培养时让它“白白胖胖、活力充沛”,目的基因的表达载体构建纯化良好,质粒间比例得当,病毒包装实验还是能有较好的结果。
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