中空纤维切向流过滤在黄病毒疫苗制备中的应用

  • 来源:瑞普利金(上海)生物科技有限公司
  • 时间: 2015/11/13
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    黄病毒属包括多种重要的人传染性病原体,如黄热病、日本乙脑、登革热及西尼罗病毒病毒等。

    赛诺菲巴斯德公司开发有多种针对性的嵌合型活性衰减疫苗,最近又开发了基于复制缺陷型黄病毒载体的新型疫苗平台——假感染病毒(PIV),其敲除了衣壳蛋白C基因或囊膜prM-E基因,从而可在这些位点插入外源基因,以用于开发针对黄病毒或非黄病毒的疫苗。


    临床用疫苗一般有较高的纯度和滴度要求,而黄病毒为有囊膜病毒,为了保证病毒的感染性,以维持其免疫原性,导致纯化非常困难。


    传统的黄病毒纯化通常使用离心或层析方法,但效率较低,且会导致病毒活性下降,而使用结合中空纤维切向流过滤和离子交换层析的两步纯化法在保证病毒的功能完整性以及料液均质性方面显示出了明显的优势。


    TFF-层析纯化法包括:


    使用中空纤维切向流过滤方法对离心澄清的病毒感染细胞培养上清液进行浓缩和洗滤,实验使用仕必纯KrosFlo 研发用 IIi TFF系统,结合500kD、85cm2聚砜中空纤维过滤组件。为降低剪切,实验使用较低的流速(130mL/min、剪切约为4000S-1)。将料液先浓缩至50mL,再以层析缓冲液进行5倍体积洗滤。洗滤过程中,跨膜压(TMP)控制在4psi以下,以降低凝胶层的形成。



    浓缩获得的截留液使用CIM Q离子交换层析整体柱进行层析纯化。

    对获得的纯化病毒通过基于Vero细胞的免疫集落分析(IFA)评估病毒滴度,并通过SDS-PAGE和WB方法确定纯度,包括宿主细胞蛋白及dsDNA杂质的含量。


    实验中发现,如直接对澄清后料液进行层析处理,洗脱液中会出现大量的非病毒蛋白杂质,所以,为提高纯度,在层析前对料液进行了TFF处理。

    TFF比较了100kD和500kD两种规格的组件,两者的回收率均可达到~80%,但前者的回流液中会出现宿主细胞蛋白,而使用后者可基本清除杂质蛋白。




    浓缩/纯化后料液中的病毒滴度高出原始料液1-2数量级,且从杂质性宿主细胞蛋白及dsDNA方面比较的话,其纯度分别是原始料液的1322-4005倍和243-422倍。感染性病毒的总回收率可达60%。

    综上所述,使用结合中空纤维切向流过滤和强离子交换层析的两步纯化法可制备高纯度、高滴度的黄病毒颗粒,且不造成病毒感染性的损失。

    CIM Q的选择主要是基于病毒颗粒的表面理化特性,而中空纤维TFF的选择则主要是考虑了病毒的剪切敏感性。传统的平面膜包超滤系统往往配有用于形成湍流的筛网,目的是降低处理过程中凝胶层的形成,但会形成较高的剪切作用,而中空纤维的开放式流道结构和错流模式可形成平稳的层流,更利于保持感染性病毒的活性。

    感染性病毒的高回收率说明CIM的对流形式与中空纤维的低剪切特性可使工艺更加温和,以维持病毒的感染性;而对产物的纯度分析显示,这种方法制备的产物纯度远高于传统方法,杂质dsDNA及宿主细胞蛋白质可被有效清除。这种方法可简单地进行规模放大,故而在临床用制品的下游处理中具有较大的应用潜力。

     

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