肿瘤诊断用外泌体的连续过滤分离

  • 来源:瑞普利金(上海)生物科技有限公司
  • 时间: 2015/11/13
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    肿瘤的早期诊断对于患者的治疗具有重要的意义,而大多数方法在特异性、可操作性及经济性方面均较满足世卫组织的要求,如针对肿瘤代谢产物、蛋白质生物标记物或循环肿瘤细胞的检测。


    外泌体是由细胞内多泡小体与细胞质膜融合后释放进入细胞外环境的磷脂双分子层包封囊泡,直径约40-100nm,其在血清和体液中的丰度较高,且含有肿瘤源性核酸、蛋白质和其它生物标记物,可能在肿瘤发生和转移过程中扮演着重要的角色,在肿瘤的预测及早期诊断上具有较大的临床应用潜力。


    但现有的外泌体分离技术,如离心、超速离心、磁珠分离以及基于亲和捕获的微流方法,非常耗时,且纯度、处理量、重复性较差,还有可能导致外泌体表面修饰,不利于后续功能分析。

    而使用简单的三步连续过滤方法,包括直流预过滤、切向流过滤和低压蚀刻膜过滤,可从细胞培养上清或体液中高效分离外泌体,保证较高的纯度、确定的粒径分布以及功能性完整,并有效去除游离的蛋白质和其它低分子量物质、大于100nm的细胞外囊泡以及细胞碎片。

    三步连续过滤操作包括:

     

    0.1μm 直流过滤


    以MDA乳腺癌细胞培养获得的150ml上清液先用0.1μm直流滤器过滤去除漂浮细胞、细胞碎片以及较大的刚性培养基成分,外泌体和较大的柔性颗粒通过膜。

    500kD 切向流过滤

    将收集的滤液转移至锥形瓶中,并在4℃条件下进行切向流过滤,使用KrosFlo 研发用 IIi 切向流过系统,结合500kD MidiKros mPES中空纤维过滤组件。包括游离蛋白在内的小分子通过中空纤维膜孔进入滤液,而包括外泌体和小囊泡在内的大分子,被截留在循环液中,并浓缩至50ml。

    然后再以PBS进行5体积的恒体积洗滤,以进一步去除小分子污染物。洗滤结束后,将回流样品浓缩至~10ml,并以10ml PBS冲洗系统,回收管路及过滤器内可能残留的外泌体,提高收率。




    过滤过程中,通过压力监测和背压阀调节,将跨膜压控制在1.5-2.5psi的较低水平,以避免较小的外泌体被“挤”入滤液。

    100nm 蚀刻膜过滤

    收获的回流液再用100nm蚀刻膜过滤器过滤。过滤时将跨膜压控制在3.5psi以下,以避免柔性的非外泌体小囊泡通过进入滤液。


    对于连续过滤法获得的外泌体样品,使用动态光散射、纳米示踪、免疫金标记透射电镜、总蛋白、斑点杂交以及LC-MS/MS蛋白组学等方法进行检测分析,并超速离心获得样品比较。


    结果显示,连续过滤可获得高纯度的外泌体,且由于分离过程中的外力较低,外泌体可保持功能性完整。而整个过程可开发成完全自动化的系统,节省操作时间,降低人工操作可能导致的变异,并降低过滤过程的压力波动。这种分离方式的大规模样品处理能力,使其可作为新型、完全非侵入的肿瘤筛选方法。


    此外,切向流过滤也可用于去除含血清培养基中的外泌体,由于某些外泌体具有免疫特性,可能会增强调节T细胞功能、抑制自然杀伤细胞或者诱导T细胞凋亡,影响整体细胞培养产品的性能。最近已有“无外泌体FBS”产品发布。而使用500kD 的中空纤维切向流过滤技术可有效去除细胞培养基中的外泌体。

     

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