“灌流“这件小事~~

  • 来源:瑞普利金(上海)生物科技有限公司
  • 时间: 2017/8/29
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    连续工艺




    连续生物工艺(Continous Bioprocess)可提高生物工艺效率已成为生物制药行业的共识,与传统批量(Batch)或补料分批(Fed-Batch)模式相比,这种生产方式可使用更小的设备,获得与大规模设备相当或更高的产量。


    连续工艺包括上游和下游的操作,为了尽可能地实现连续工艺的优势,需有效地整合上游细胞培养和收获以及下游的产物纯化等操作,甚至构建“end-to-end”的连续工艺平台,而细胞培养操作是决定工艺是否“连续”以及整体工艺产率的核心。


     

    整合式连续工艺(V.Warikoo等,2012)

     


    灌流细胞培养

     

    虽然在过去一段时间来,通过培养基等的优化,补料分批等传统工艺已经可达到极高的产物滴度。但是,大多数制药公司仍在不同工艺上应用灌流工艺,以期实验细胞培养的全部潜能,达到更高的产物,特别是产物不稳定的应用。

     


    灌流模式的选择

     

    目前,基于中空纤维切向流过滤的细胞截留装置是灌流应用的主流,因为可实现100%的细胞筛分和线性的规模放大,而根据所选的中空纤维的组件和目的产物的截留方式,灌流又可分为滤出式灌流和浓缩灌流,前者可视为真正的灌流,其通常使用0.2μm、0.65μm甚至更大孔径的组件,细胞截留在反应器内,目的产物与废弃培养基一起从滤出端流出收获,以及时储存或进行下游纯化。


    后一种方式一般使用30或50kD的超滤组件,目的产物和细胞一起截留在罐内,培养结束后,一起收获,这种方式跟补料分批方式相似,所以也称为浓缩补料分批(Concentrated Fed-Batch,CFB),其相比前一种方式更加简单,因为不涉及产物的多个“亚批次”收获以及批次及产物一致性的鉴定问题,是在固定体积反应器内,短时间实现产品“超常”产量的简单方式,但这种方法一般只适用于产物比较稳定的应用,如常规的单克隆抗体(mAb)。如产物不稳定,较易受罐内温度、pH及蛋白酶影响,而发生降解时,只能选用前一种方式。


     

    用于灌流的可规模放大的中空纤维组件



    灌流操作

     

    灌流操作时,一般在生物感应器接种后,经过开始的批量生长阶段,然后使用细胞截留设备,以恒定收获速率开始去除无细胞的上清液,即灌流速率,以每日罐体积(VVD)计算,同时,向培养液中补加等量的新鲜培养基。

     

    灌流速率的调节,可根据细胞密度的增加、营养底物的消耗以及代谢产物形成的增加等为参考,从而为每细胞每天提供特定量的新鲜培养基。常规的灌流速率一般在每天1-2个罐体积。在一定条件下,达到特定细胞密度后,可通过细胞废弃(cell bleeding)从罐内去除一部分培养液,建立确定的细胞生长速率,以维持较高的细胞活性,防止细胞截留装置堵塞。因为细胞活性降低时,死细胞裂解产生的细胞碎片和释放的核酸及蛋白质等,很容易造成膜表面“污染”和膜孔堵塞。


    中空纤维的选择


    对于灌流组件的选择,可参考切向流过滤时组件选择的参数,因为两者同样基于过滤,可考虑的参数包括体积通量(volume throughout,VT)、剪切(shear rate)以及滤液通量(permeate flux)等,但是灌流和下游过滤的操作又有差异,比如,由于灌流时间较长,其体积通量通常远高于过滤,而为了控制灌流速率,其瞬时滤液通量一般会低于过滤时的平均通量。而各因素又相互关联,例如,如需达到较高的灌流速率时,需达到较高的瞬时滤液流速,此时,会较容易造成膜堵塞,从而降低膜的总体积通量,在此情况下,即使是体积较小的反应器,可能也需要较大膜表面积的组件,相反,相对较小的组件,也可能可用于较大的反应器。

     

    灌流生物反应器

     

    笼统来讲,适合细胞培养的生物反应器,只需结合合适的细胞截留设备,都可进行灌流培养。灌流工艺可在2L甚至更低的培养规模进行开发,经小规模反应器上进行可行性研究和工艺优化后,逐步放大至中试及 >1000L生物反应器。灌流需要外反应器外构建循环回路,回路应尽量短,以减少细胞暴露于“不受控”的罐外条件的时间,另外,也应避免细胞在罐外滞留 。循环回路可通过无菌快接头与反应器进行简单、快接的连接,而使用预灭菌的流路,进一步降低了灌流前的准备时间。仕必纯的一次性灌流流路与一次性反应器是天生一对,而对于不锈钢生物反应器,我们也可提供相应的无菌连接方案。

     

    进行高密度细胞灌流培养时,应特别注意反应器通气系统的有效性,保证一定的氧传质率,以为培养液提供充足的氧气,反应器具有出色的氧传质率,可降低对通气的要求,这可降低尾气滤器堵塞和罐内高压的风险。同时,反应器需能及时去除高细胞密度所产生的大量的二氧化碳,以避免其抑制生产,以为对产物可能造成的负作用。另一个不能忽视的问题是,由于浓缩灌流较高的气流速率和蛋白含量,在尾气中可能会有过量的气溶胶形成,需注意降低尾气过滤器堵塞风险,提高工艺稳定性。

     

    此外,保证从研发到中试及生产用反应器的“几何相似性”,如反应器的径高比以及搅拌桨的设计和配置等,也是细胞灌流培养工艺稳定规模放大所需考虑的。而使用合适的在线监测器,如pH和DO电极,可提供细胞培养代谢信息, 而对营养物质和代谢产物的监测,如葡萄糖和乳酸,可为营养底物的补充和培养总体代谢状态提供信息,以确定最佳的营养物质补加速度。

     


    展望

     

    生物制药公司为具体工艺选择补料分批还是开发连续细胞培养方法,取决于诸多因素,比如对产量的要求、现有设备和技术情况以及构建的细胞株的状态等等。但是,技术的创新必不断加快工艺的革新。


    参考文献:

    V.Warikoo, R.Godawat, K.Brower, et al., Interated Continuous Production of Recombinant Therapeutic Proteins. Biotechnoloy and Bioengineering, 2012(109),12:3018-3029.

    M.Sherman,V.Lam,M.Carpio,et al., Continuous Cell Culture Operation at 2000L Scale.Bioprocess International, 2016(14),10:22-28.

    J.Walther, R.Godawat,C.Hwang.,et al.,The business impact of an intergrated continuous biomanufacturing platform for recombinant protein production. Journal of Biotechnology, 2015(213):3-12.



     

     

     


     

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