脂质体制备中的切向流过滤(二)

  • 来源:瑞普利金(上海)生物科技有限公司
  • 时间: 2017/9/1
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    盐酸阿霉素(Dox)是一种源于蒽环类药物的抗肿瘤抗生素,这类药物的作用机制是通过不同的方式与DNA反应,包括插入、DNA链断开以及对拓扑异构酶II活性的抑制。但由于其剂量相关性的心脏毒性和骨髓抑制作用,使用会有限制。

    阿霉素脂质体被鼓励用于卵巢、肺和乳腺癌的治疗,因其具有更高的效力,同时降低了心脏毒性。因为脂质体形式的Dox可在循环系统中维持更长的时间,将更多的药物递送至目标癌细胞或肿瘤,避开正常细胞,提高生物利用度,降低代谢,增强Dox的治疗效力。但是,传统的脂质体由于可被网状内皮系统(RES)的细胞快速摄入,降低了到达肿瘤的药物量,而导致了效力的局限性。 

    为克服这一限制,将聚乙二醇(PEG)共价结合到脂质双分子层,可获得更小、更加刚性的脂质体。PEG修饰的Dox脂质体是一种Dox脂质体的“长循环”剂型,已被FDA批准,这是用于药物递送系统的纳米技术的一个新突破,其可渗入靶细胞,以递送生物活性药物。

    PEG在脂质体表面形成保护层,PEG修饰的脂质体具有更长的循环时间,降低RES细胞的摄入,同时包封药物的释放更慢,进而增加在肿瘤中的药物累积。

    PEG修饰Dox脂质体制备 

    使用脂质薄膜水合法:首先磷脂称量并溶解,HSPC、胆固醇和DSPE-PEG2000(3:1:1 w/w)溶解于氯仿,蒸发去除有机溶剂,形成干的脂质膜,加入柠檬酸溶液水化脂质薄膜。

    然后,使用高压均质乳化仪降低脂质体尺寸,60℃,10,000psi压10个循环。悬液用0.2μm膜过滤。

    之后,再使用MWCO 10kD的MicroKros中空纤维组件进行切向流过滤,将脂质体外部缓冲液置换为pH 7.5 的 Hespes 缓冲液。精确加入定量的盐酸阿霉素,50℃,80rpm搅拌30min。产物用0.2μm膜过滤,装入玻璃瓶,于8-10℃保存。 

    检测

    使用透射电镜检测脂质体形态和结构,动态光散射检测脂质体尺寸、分布和Zeta电位。使用HPLC法对Dox进行定量,分光光度法检测磷脂量。 

    包封效率使用透析法检测,将1mL PEG修饰的Dox脂质体加入MWCO 12-14kD的Spectra/Por 透析袋内,放入含有100mL pH4.0 磷酸缓冲液的烧瓶内。8-10℃透析12h。取透析袋外部溶液,在233nm波长下,检测光密度。计算包封率。

    之后,使用小鼠移植瘤模型,评估PEG修饰Dox脂质体对HT29 结肠癌细胞的体内效力。

    结果

    制备的脂质体平均粒径95nm,较小的颗粒尺寸可提高药物在肿瘤中的累积。多分散系数0.138,显示制备的脂质体具有较好的均一性和物理稳定性。Zeta电位反应了颗粒之间的排斥力,Zeta电位-27.8mV,证实其具有较好的稳定性。Dox含量~2mg/ml,药物包封率97.5%,较高的包封率说明制备的脂质体符合对脂质体产品的要求。

    TEM结果显示制备的脂质体具有相对平均的尺寸。(H.P.T.Minh, et al., 2015

     

    人结肠癌HT29肿瘤小鼠模型实验显示,PEG修饰Dox脂质体可降低肿瘤体积,且具有更低的细胞毒性,与对照的商品化Lipo Dox结果相似,而显著优于游离Dox。


    原文:H.P.T.Minh, L.L.Phuong,H.N.Thanh,rt al., Development and evaluation antitumor activity of PEGylated liposomal doxorubicin on tumor-bearing BALB/c-Foxnlnu mice model. Journal of Applied Pharmaceuical Science, 2015.

     


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