人白细胞介素3 ELISA试剂盒

  • 来源:北京索莱宝科技有限公司
  • 时间: 2018/9/7
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    人白细胞介素3 ELISA试剂盒

    产品编号:SEKH0010

    适用于人血清、血浆或细胞培养上清液等样本


    背景介绍:
    IL-3又称为多能集落刺激因子(Multi-CSF),主要由活化的CD4+T细胞产生。其主要作用为促进骨髓中多能造血干细胞的定向分化与增殖,产生各种类型的血细胞。人IL-3基因定位于第5号染色体,与IL-4, IL-5和GM-CSF的编码基因临近。人IL-3的cDNA编码一个133氨基酸残基的成熟多肽以及一个19氨基酸残基的信号肽。人和小鼠IL-3 在氨基酸水平的同源性近29%, 因此其生物学活性具有种属特异性,人IL-3主要由活化的T细胞、NK细胞、肥大细胞、上皮细胞、基质细胞、神经元和星形细胞产生。IL-3还可调节多种成熟细胞的生长、分化及相关的基因表达,如C-MYC、IL-2RA基因等。


    检测原理:

    Solarbio (Solarbio ®) ELISA试剂盒采用基于双抗体夹心法的酶联免疫吸附检测技术。将抗人IL-3单克隆抗体包被在酶标板上;分别加入梯度稀释的标准品和预稀释的样本,标准品和样本中的人IL-3会与酶标板上的包被抗体充分结合;洗板后加入生物素化抗人IL-3抗体,该抗体会与板子上包被抗体捕获的标准品和样本中的人IL-3发生特异性结合;洗板后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的链霉亲和素,生物素与链霉亲和素会发生高强度的非共价结合;洗板后加入显色剂底物TMB,若反应孔中样品存在不同浓度的人IL-3,则HRP会使无色TMB变成不同深浅(正相关)的蓝色物质,加入终止液后反应孔会变成黄色;最后,在λmax=450 nm(OD=450 nm)处测定反应孔样品吸光度(OD),样本中的人IL-3浓度与OD成正比,通过绘制标准曲线和四参数拟合软件便可计算出样本中人IL-3的浓度。


    注意事项:
    1.试剂盒应在有效期内使用,请不要使用过期的试剂。
    2.试剂盒未使用时应保存在2-8℃冰箱,已复溶但未用完的标准品,请丢弃。
    3.试剂盒使用前请在室温恢复30 min,且充分混匀试剂盒里的各种成份及制备的样品。
    4.在试验中标准品和样本建议作复孔检测,且加入试剂的顺序应保持一致。
    5.为避免交叉污染,请在试验中使用1次性试管,枪头,封板膜(※)及洁净塑料容器。.
    6.浓缩生物素化抗体和浓缩酶结合物的体积较少,在运输过程中微量液体会沾到管壁及瓶
    盖上,使用前请离心处理(5-10 S即可),使管壁上的液体集中在管底部,取用时,请用移液器小心吹打几次。
    7.除了试剂盒中的浓缩洗涤液和终止液可以通用外,请不要使用其他来源试剂盒内含的
    试剂代替本试剂盒中的某单个组分。
    8.为保证结果准确,每次检测均需做标准曲线。

    安全提示:
    试剂盒中的终止液为酸性溶液,操作人员在使用时请带上手套并注意防护;在操作过程中也要避免试剂接触皮肤和眼睛,如果不慎接触,请用大量清水清洗;检测血液样本及其它体液样本时,请按国家生物实验室安全防护有关管理规定执行。



    自备实验器材(不提供,可代购)
    1.酶标仪(主波长450nm,参考波长630nm)
    2.高精度移液器及一次性吸头:0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
    3.洗板机或洗瓶
    4.37℃孵育箱
    5.双蒸水,去离子水,量筒等
    6.稀释用聚丙烯试管


    样本收集及储存:
    1.细胞培养上清:
    将细胞培养基移至无菌离心管,在4℃条件下1000 ×g离心10 min,然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存(24小时内检测可放入2-8℃储存),避免反复冻融。
    2.血清样本:
    室温血液自然凝固20 min后,在4℃条件下1000×g离心10 min,然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存(24小时内检测可放入2-8℃储存),保存过程中如有沉淀,请再次离心,避免反复冻融。
    3.血浆样本:
    将全血收集到含抗血凝剂的管中,根据标本的实际要求选择EDTA,柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂,混合20 min,在4℃条件下1000×g离心10 min,然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存(24小时内检测可放入2-8℃储存),避免反复冻融。

    ※注意:血清血浆样本避免使用溶血、高血脂样本,以免影响检测结果;如果样本中的靶标物检测浓度高于标准品的最高值,请将样品做适当倍数稀释后检测,建议正式实验前做预实验以确定稀释倍数。


    试剂准备:
    1.试剂回温:首先在实验前30 min将试剂盒,待测样本放置于室温下,浓缩洗涤液如出现结晶,请放入37℃温浴直到结晶全部溶解。
    2.配制洗涤液:预先计算好稀释后的洗涤液使用体积,然后用双蒸水或去离子水将20倍浓缩洗涤液稀释成1倍应用液,未用完的浓缩洗涤液放入4℃冰箱保存。
    3.标准品梯度稀释:加入标准品/样本稀释液(SR1)1ml至冻干标准品中,静置15分钟待其完全溶解后轻轻混匀(浓度为1000pg/ml),然后在其余七管中各加入500L标准品/样本稀释液(SR1),按照以下浓度进行2倍稀释:1000、500、250、125、62.5、31.2 、15.625、0pg/ml进行稀释。1000pg/ml标准曲线最高点浓度,标准品/样本稀释液(SR1)作为标准曲线的零点(0pg/ml)。复溶过的标准品原液(1000pg/ml)
    未用完的应废弃或根据需要按照一次用量分装,并将其贮存在-20~-80℃冰箱,具体如下图。


    4.生物素化抗体工作液:预先计算好试验所需用量,用检测稀释液(SR2)将100倍抗体浓缩液稀释成1倍应用工作液(稀释前充分混匀),请在30分钟内加入到反应孔中。


    5.酶结合物工作液:按每次试验所需用量配制,用酶结合物稀释液(SR3)将100倍浓缩酶结合物稀释成1倍应用工作液(稀释前离心),请在30分钟内使用。



    6.洗涤方法:
    自动洗板:甩尽酶标板孔中液体,在厚迭吸水纸上拍干,注入洗涤液为300ul/孔,注
    与吸出间隔为30秒,洗板5次。
    手工洗板:甩尽酶标板孔中液体,在厚迭吸水纸上拍干,用洗瓶加入洗涤液300ul/孔,静止30秒后甩净酶标板孔中液体,在厚迭的吸水纸上拍干,洗板5次。


    结果判断:
    1.用酶标仪 450 nm 波长测定 OD 值。选择双波长检测,参考波长为 630 nm。如不能进行双波长检测,请用 450 nm 的OD测定值减去630 nm的OD测定值。
    2.计算标准品、样品的平均OD值:每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值
    3.以标准品浓度为横坐标,吸光度OD值为纵坐标,用软件绘制标准曲线,样品中IL-3含量可通过对应OD值由标准曲线换算出相应的浓度。
    4.若标本OD值高于标准曲线上限,应做适当稀释后重新检测,计算浓度时再乘以稀释倍数。




    1.数据及标准曲线


    本图仅供参考,应以当次试验标准品绘制的标准曲线计算人IL-3的样本含量


    2. 灵敏度:
    最低可检测人IL-3浓度达8pg/ml
    20个零标准品浓度OD的平均值加上两个标准差,计算相应的可检测浓度。

    3. 特异性:
    不与人G-CSF、GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3 Rα、IL-3 Rβ、IL-4 IL-6、IL-7、IL-8、TGF-β1  、TNF-α、 TNF-β反应,小鼠GM-CSF、IL-1β、 IL-3、IL-4 、IL-5、IL-6、IL-7等反应。

    4. 重复性:
    板内,板间变异系数<10%。

    5. 回收率:
    在选取的健康人血浆、细胞培养上清中加入 3 个不同浓度水平的人 IL-3,计算回收率。


    6. 线性稀释:
    分别在选取的4 份健康人血浆和细胞培养上清中加入高浓度人 IL-3,在标准曲线动力学范围内进行稀释,评估线性。



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