数字PCR在乳腺癌预防及诊断中的应用

来源: 伯乐生命医学产品(上海)有限公司   2013-5-23   访问量:6134评论(0)

乳腺癌是女性排名第一位的常见恶性肿瘤。2011年美国CA: A Cancer Journal for Clinicians杂志公布的最新统计数据显示,美国2011年预计将有超过23万女性罹患乳腺癌,占女性新发恶性肿瘤的30%。其中15%-25%的乳腺癌患者显示为HER-2基因过表达。

HER-2/neu(又称c-erbB-2)基因为表皮生长因子受体家族成员之一,是一种原癌基因,研究表明,HER-2/neu基因扩增或过表达的乳腺癌患者易早期复发且生存期缩短。检测HER-2基因是否高表达对于患者的预后判断、治疗方案的选择具有重要意义,HER-2是乳腺癌明确的预后指标和药物治疗效果的预测指标。

目前,《乳腺癌HER2检测指南(2011版)》仍推荐IHC与FISH和(或)CISH相结合的检测策略。IHC操作简便,实验成本低,但是其分析结果是主观的,可变的,不同的抗体和不同的实验人员都可能引发结果的不确定性,检测结果受样本要求及缺乏判断标准等;而CISH在研究数据支持方面则远不如IHC与FISH。因此,以HER-2位点特异性荧光原位杂交探针为基础的FISH方法仍被认为是"金标准"来判断HER-2在DNA水平上的扩增结果,尤其对低度扩增的检测更为重要。FISH检测耗时长,操作步骤繁琐,实验结果的判读过分依赖于实验人员的经验,而且临床研究中发现FISH检测也存在一定的局限性。

为了提高HER-2检测的精确性及检测通量,有很多实验室开始使用qPCR平台进行HER-2定量分析及拷贝数变异分析,但是这种方式属于相对定量分析,精确性有限,不能有效区分微小的基因表达变化和拷贝数变异,尤其是对于异质样本来说更为困难。

商业化数字PCR平台的出现,为提高HER-2检测的准确性提供了很好的解决方案。QX100微滴式数字PCR系统采用创新的微滴化技术,将含有DNA或RNA的PCR反应体系分成约20,000个微滴。经PCR扩增后,逐个对每个微反应进行检测,有荧光信号的微滴判读为1,没有荧光信号的微滴判读为0,根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。

密西西比大学医学中心和Bio-Rad Digital Biology Center的科学家们发现使用QX100微滴式数字PCR平台可以对HER-2基因的表达水平及基因组拷贝数变异进行精准的定量分析。图1显示在使用新鲜冻存的样本为实验材料,对其cDNA进行2倍浓度稀释后,以GAPDH作为参照基因,对HER-2基因的表达水平进行分析。图中结果清晰显示使用双重体系检测的浓度梯度具有很好的线性关系,而且使用GAPDH校正后的基因比例一致性。同时,该文献还指出,使用EEF2作为内参基因,对相同的实验体系进行HER-2基因表达分析获得了类似的实验结果。

图1.HER2RNA水平浓度检测的线性分析

样本为Origene公司的新鲜冻存样本CR561507cDNA2倍浓度梯度稀释,使用双重反应体系,HER-2(FAM标记,图中蓝色方块显示),GAPDH(VIC标记,图中绿色方块显示)。经GAPDH校正后的HER2浓度显示为红褐色的圆圈。每个点的误差线标示95%的置信区间。

更进一步地,针对临床样本HER-2基因拷贝数变异分析的研究中,不同的实验室也得到了类似的实验结果。在针对39例临床样本的ddPCR分析中,ddPCR结果显示其中的10例样本HER-2基因组拷贝数大于4.4,显示为HER-2阳性。剩余29例为HER-2阴性,HER-2基因组拷贝数为1.6-3。这个结果与之前IHC和FISH的结果完全一致。

以上这些实验结果都表明,ddPCR可以作为HER-2基因拷贝数分析的有力工具,无论是DNA水平,还是RNA水平的拷贝数变化,都可以通过QX100准确获悉。而且,针对目前临床使用较多的技术,FISH和IHC这类显微观察为基础的技术操作步骤繁琐,实验结果的判读过分依赖于实验人员的经验。有临床数据发现17号染色体扩增导致HER-2基因表达增加可引起HER-2蛋白过表达(IHC3+)与HER-2基因扩增(FISH+)不一致的情况,FISH检测结果存在一定的不足之处。数字PCR的出现,为临床HER-2诊断提供了很好的科研思路和诊断策略。

与此同时,我们还发现,有一些科学家开始使用QX100微滴式数字PCR平台进行乳腺癌预防相关的前瞻性研究。最新的一篇QX100相关文献报道了日本科学家关于体细胞拷贝数变异与乳腺癌易感性关联的最新研究成果。在此篇文献中,科学家通过患者组和正常组的比较基因组学杂交芯片筛选到一些乳腺癌相关的CNV,并通过QX100对其中的6个CNV位点进行了拷贝数验证,通过相关的统计学分析发现,其中一部分CNVs与乳腺癌的易感性密切相关,这些CNVs位点可以作为乳腺癌风险预警的分子标志。

综上所述,方兴未艾的数字PCR技术在乳腺癌预防及诊断中发挥着越来越重要的作用,在HER-2基因的表达水平和拷贝数分析的研究中,使用ddPCR可以对DNA和RNA中的HER-2基因进行精准定量,可以为乳腺癌的分子分型及诊断提供有力的帮助,ddPCR的实验结果对于乳腺癌的治疗及预后评估具有重大的指导意义。同时,在针对癌症早期预防和癌症易感性的前瞻性研究中,ddPCR平台可以联合高通量测序及比较基因组杂交芯片技术,对已筛选到的未知突变或者低丰度表达/变异基因进行准确的鉴定分析,与高通量筛选平台互为印证,严谨、系统地阐述全新的科研成果。(生物谷Bioon.com)



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