SYBR 实时荧光定量PCR技术

来源: 武汉优博生物技术有限公司   2017-12-5   访问量:333评论(0)

武汉优博生物技术有限公司开发的SYBR实时荧光定量PCR(Real-time PCR)就是PCR反应体系中加入荧光染料与DNA双链的结合的原理,实时监测整个PCR进程判定即时测定特异性产物的量和推断出初始基因的量,可快速、灵敏的检测样本的RNA和DNA在动物病原体基因的检测,畜禽产品的检验检疫,生物制品的鉴定等领域广泛应用。

与常规PCR反应相比,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。

武汉优博生物技术有限公司技术人员根据荧光定量PCR原理常规PCR基础上加入相应的荧光染料来实现其定量功能的。随着PCR反应的进行,PCR反应产物逐渐增加,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图。

荧光扩增曲线可以分成三个阶段:荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖,无法判断产物量的变化。而在平台期,扩增产物已不再呈指数级的增加,PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系,根据最终的 PCR 产物量也不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段, PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系,我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便,在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念:荧光阈值和 CT值(如下图所示)。

Ct 值:是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。
研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表Ct值如下图所示。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

荧光域值(threshold)的设定

PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,即:threshold = 10’SDcycle 6-15

Ct值与起始模板的关系

研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代Ct值。因此,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数 Real-time PCR详细介绍

武汉优博生物技术有限公司开发的SYBR实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测技术为国内首创,与国际品牌的公司开发的技术相比,具有检测技术更灵敏,成本更低,实用性更强的优势。



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