拨开迷雾:荧光定量内参基因

来源: 上海前尘生物科技有限公司   2017-12-11   访问量:1476评论(0)

拨开迷雾:荧光定量内参基因

我们在进行qPCR实验时,对于内参基因的选择往往会不假思索地选择GAPDH和β-actin18S rRNA之类的内参基因。貌似除了这些,我们并没有别的更好的选择。即使你对这些基因产生了质疑,无论是查阅参考文献还是与师兄师姐讨论过后,依旧还是义无反顾的选择之前的选择。久而久之,GAPDH和β-actin18S rRNA三位在内参基因界的江湖地位就已经不可动摇了。

大家都知道,内参基因的作用就是去除不同样本在RNA产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别,从而获得目的基因特异性表达的真正差异。所以,我们会选择内参基因进行校正和标准化。通常我们选择内参基因的标准是①高度或中度表达,排除太高或者太低;②表达水平不受任何外源性因素等影响;不存在假基因。

今天我们来扒一扒上述三个内参基因。

GAPDH

为什么GAPDH被选作内参基因?

GAPDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶的缩写,经典的糖酵解反应中的一个酶。该酶广泛存在于众多生物体中,并且在细胞中含量丰富,占总蛋白的10%-20%GAPDH基因有高度保守的序列,在同种细胞或者组织中的蛋白表达量一般是恒定的。故长期以来该基因被广泛用作qPCRWestern blot中的内参基因。

GAPDH不适合选作内参的情况

GAPDH基因是糖酵解中的关键基因,正是因为如此,在代谢中过程中的表达很容易受到多种因素的影响。如在细胞的增殖过程中,细胞需要的能量ATP增多,糖酵解代谢加大,GAPDH基因的表达水平很有可能被上调。有报道称,该基因可作为肿瘤发生的标志物,在肿瘤组织与正常细胞及癌旁正常组织比较时,GAPDH表达并不一致。故在比较肿瘤组织与正常组织或细胞的某种基因或蛋白的表达时,GAPDH作为内参应慎重。

fig1-gapdh

GAPDH基因功能的多样性

β-actin

为什么β-actin被选作内参基因?

β-actin选作内参基因因其序列高度保守,其mRNA表达数量高,是横纹肌肌纤维中的一种主要的蛋白成分,也是肌肉细丝及细胞骨架微丝的主要成分。该基因几乎在所有真核细胞中表达,广泛存在哺乳动物动物的组织与细胞内。故其作为内参基因是得到公认的。

β-actin不适合选作内参的情况

对于actin蛋白由几种异构体组成,actin大致可以分为6种,存在于组织分布特异性,不同actin之间具有较大的序列相似性(>90%)。在肌肉组织中β-actin分布很少,心肌中主要是alpha-cardiac muscle actin蛋白。故并不是所有的组织都适合选β-actin作为内参。例如当细胞向恶性转化时,β-actin mRNA的表达水平增加;而假基因的的存在也可干扰β-actin的检测,此时并不适合选择β-actin作为内参。

18S rRNA

18S rRNA30多种核糖体蛋白共同构成真核生物核糖体40S小亚基,从而与60S大亚基一起完成细胞中的蛋白质合成。

为什么18S rRNA被选作内参基因?

18S rRNA作为内参的原因可总结如下:18S rRNA存在于核糖体小亚基中,其编码基因rDNA18S rRNA/rDNA)在生物演化过程中相当保守;存在于所有真核生物细胞中; 易于使用通用引物扩增;rRNA的合成是由RNA聚合酶I合成,mRNA是由RNA聚合酶II合成,因此rRNA合成的调节独立于mRNA,在影响mRNA表达的各种条件下,各种rRNA水平很少发生变化;rRNA属于高峰度表达,远远高于目标mRNA,较其他内参基因稳定且受RNA降解影响较小。故18S rRNA被广泛选作内参。

同样是rRNA5S rRNA5.8S rRNA以及28S rRNA就不适合作为内参,因为5S5.8S在核糖体大亚基中的rRNA分子序列短,提供的信息少;28S rRNA序列虽然较长,可提供更多的信息,能更准确地揭示系统发育的规律,但基因数据库中相关信息较少,不利于比较分析。

18S rRNA不适合选作内参的情况

然而,rRNA的转录易受到各种生物因素和药物的影响。在有丝分裂期间,28S18S rRNA明显减少或停止表达。此外存在很大争议的是rRNA不包括poly(A)尾,在以oligo(dT)为引物的cDNA合成中不能被逆转录,建议在反转录的过程中除用oligo(dT)引物外,还要用18S作为反向引物,反转录后的cDNA最好用RNA酶处理一下,再高温灭活。

其他内参基因的表达情况

其实不仅仅是GAPDH和β-actin18S rRNA这三个基因在作为内参基因的存在问题,其他的很多内参基因在不同组织中的表达水平也是存在较大差异的。如不同内参基因在不同组织中表达波动较大的HPRT基因△CT10.3;同一内参基因在不同的组织中,如心,脑,胎盘,肺,肝,骨骼肌,肾等组织中表达也不是恒定的。见下图:

IMG_256

不同的内参基因在不同组织中△CT变化

文本框: 不同内参基因在不同组织中表达差异IMG_256

结论

没有一种RNA的表达水平在所有条件下是恒定的,在各种因素的影响下,如细胞周期的不同阶段,内参基因的RNA表达水平是变化的。至今,不存在任何一种基因适用于所有类型的细胞或组织。故我们研究者应该根据自己所研究的细胞和组织类型以及实验要求,做预实验。从多种内参基因中筛选出适合自己实验的稳定表达的内参基因。同时也可以选择多内参基因的研究方法,设置两个或两个以上内参基因,取平均值,然后去校正自己的目的基因能够得到更可靠的结果。

参考文献

(1)Radonić A, Thulke S, Mackay I M, et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2004, 313(4):856.

(2)Mazurek S, Grimm H, Boschek C B, et al. Pyruvate kinase type M2: a crossroad in the tumor metabolome.[J]. British Journal of Nutrition, 2002, 87 Suppl 1(S1):S23.

(3)Nicot N, Hausman J F, Hoffmann L, et al. Reference gene selection for RT-qPCRnormalization in potato during biotic and abiotic stress[J]. Journal of Experimental Botany, 2005, 56(421):2907-2914.

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