Etaluma显微镜:用反卷积助力三维荧光细胞成像

来源: 锘海生物科学仪器(上海)股份有限公司   2019-4-12   访问量:1046评论(0)

众所周知,宽场显微镜的分辨率在X、Y平面上接近衍射极限,但在Z轴上分辨率较低。1953年,马文·明斯基(Marvin Minsky)引入共聚焦显微镜这一概念,通过使用针孔(pinhole)屏蔽焦平面以外的发射光,从而提高分辨率,特别是在Z轴上。这使得很薄的Z轴切片图像可以被采集到,甚至通过采集多个Z轴切片图像,可以重构出三维图像。但是这种能力是以采集时间和光毒性为代价的,更不用说硬件本身的成本了。


模糊标记线粒体,解卷积时间8秒


120nm分辨率微丝,解卷积时间4.9秒


人骨肉瘤细胞株SaOS2,反卷积时间2秒


“在整个图像采集过程中,宽场显微镜使用相对较弱的光照射整个样本,这样分散到每个像素上能量相对较弱,但激光扫描共聚焦显微镜将所有光在很短的时间内集中在一个像素上,然后进行逐个像素扫描。假设在普通宽场和激光共聚焦成像中使用相同的总功率,激光扫描的瞬时功率(即强度)要高得多。对于一张一秒钟采集的512×512的图像,激光扫描强度是宽场照明的25万倍。” Piston et al, Nature Methods, 13:557–562 (2016).

随着活细胞成像变得越来越普遍,尤其是3D重构,降低仪器的成本和复杂性,减少光毒性变得越来越重要。与许多科学技术的发展一样,软件解决方案常常取代早期的硬件解决方案。

第一次通过使用点扩散函数(PSF)对图像进行反卷积运算处理的描述是在20世纪70年代初由Richardson-Lucy提出的同名迭代算法。(Richardson, 1972, J. Opt. Soc. Am 62:55-59, Lucy, 1974, Astron. J. 79:745) 自此,在宽场显微镜中形成了将宽场图像转化成类共聚焦图像的应用。这些算法是复杂且迭代的,需要几分钟甚至几小时去处理一堆图像。商业化的反卷积软件价格昂贵,一般在一些受限制的操作系统平台上运行,这可能不适合资源有限的用户。

位于美国加利福尼亚州森尼韦尔的Microvolution公司开发了一种并行软件方法,该方法利用为游戏开发的图形处理器单元(GPU),以比传统方法快100倍的速度进行3D图像解卷积处理。Etaluma与Microvolution公司合作,现在在我们的Etaluma显微镜中也可以体验到这种快速反卷积处理功能


LumaScop 620荧光倒置显微镜

支持明场、相差以及三色荧光(405nm蓝色荧光,488nm绿色荧光,594nm红色荧光)成像




LumaScope 720全自动倒置荧光显微镜

支持明场、相差以及三色荧光(405nm蓝色荧光,488nm绿色荧光,594nm红色荧光)成像,并配备XYZ全自动载物台。



宽场图像,线粒体。从采集到的弱荧光图像中恢复出高质量图像的示例。

单张层切2048x2048x51,解卷积时间8秒。

图片来源:Dane Maxfield, Technical Instruments


即时SIM(iSIM)图像,超分辨原始图像的分辨率208nm,反卷积处理后分辨率进一步提高(117纳米)。

单张层切1446x1131x25,解卷积时间4.9秒。

图像来源:Jim Paladino, BioVision


转盘共聚焦图像,内源性ER标记

最大强度投影512x512x41,解卷积时间0.7秒

图片来源:Cairn Research


光片显微镜图像,果蝇形态发生

单张层切946x768x321,解卷积时间22.5秒

图片来源:Dong-Yuan Chen in the Bilder lab, UC Berkeley.


人骨肉瘤细胞株SaOS2在分化条件下染色,观察成骨细胞转录因子RUNX2(红色)和分泌蛋白骨钙素(绿色)的调节。核被Hoechst 33342(蓝色)复染。可见单个骨细胞样细胞,其特征是核小而多。

最大强度投影2048x2048x32,3通道,解卷积时间17秒

图片来源:Dennis Hughes, MD, PhD, Assoc. Prof. of Pediatrics; Jared Mortus, Lead Researcher; Laurence Cooper, MD, PhD, PI; George McNamara, PhD, Sr Research Scientist; The Children’s Cancer Hospital, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX.


宽场图像,RNA FISH(荧光原位杂交),标记TOP1 (DNA topoisomerase 1).

单张层切1024x1024x39,解卷积时间6秒

图片来源:Dane Maxfield, Technical Instruments.


FluoRender中三维渲染的俯视图,HeLa细胞和入侵的克氏锥虫,显示寄生虫释放囊泡内富含肌动蛋白形成的细胞表面。

1024x1024x34,3通道,反卷积时间1.6秒

图片来源:Alexis Bonfim-Melo in the lab of Prof. Renato A. Mortara, Div. of Parasitology, Dept. of Microbiology, Immunology and Parasitology, Medical School of the Federal University of S?o Paulo.


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