Nature子刊:RIPK1如何在双面角色中切换

来源: 赛业(广州)生物科技有限公司   2019-6-3   访问量:2534评论(0)

RIPK1(受体相互作用蛋白激酶1)作为死亡信号调控的关键因子,已成为近期研究的热点。有意思的是,它就像一个“双面人”。一方面,RIPK1作为支架促进MAPK和NF-κB通路的激活,并抑制细胞凋亡和坏死性凋亡。另一方面,它作为激酶又反常地诱导细胞凋亡和坏死性凋亡。RIPK1如何在这双面角色中自由切换,目前还不大清楚。

近日,比利时VIB炎症研究中心领导的研究团队发现,IKKα/β介导了RIPK1第25位丝氨酸(Ser25)的磷酸化。它作为一种 “分子刹车”,直接抑制RIPK1的激酶活性,并阻止TNF介导的RIPK1激酶依赖性细胞死亡。

在4月份的《Nature Communications》杂志上,研究人员报道了这种精确的分子机制,让RIPK1在促生存和促死亡功能之间自由转换,并证明了其在小鼠感染和炎症模型中的生理相关性。

RIPK1上的Ser25位点被磷酸化

之前的研究表明,RIPK1是IKKα 和IKKβ 的直接底物。于是,研究人员从野生型和Ikkα/β−/−小鼠胚胎成纤维细胞中分离出TNFR1复合物I,并开展LC-MS/MS质谱分析,以鉴定出RIPK1上的磷酸化残基。他们发现,在缺乏IKKα/β 的情况下,RIPK1上Ser6和Ser25的磷酸化大大降低。结合之前的研究成果,他们证实RIPK1上的Ser25位点被直接磷酸化。

模拟Ser25磷酸化避免TNF诱导的细胞死亡

为了确认IKKα/β介导的pS25 RIPK1的生理相关性,研究人员委托赛业生物(Cyagen)利用CRISPR/Cas9技术产生了模拟磷酸化的S25D RIPK1敲入小鼠品系。Ripk1S25D/S25D小鼠是健康的,且RIPK1表达水平与Ripk1+/+小鼠无差别,表明s25d突变对ripk 1的稳定性没有影响。

他们从这些小鼠身上分离出骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)和小鼠成纤维细胞(MEF),然后开展实验。他们发现,在不存在或存在caspase抑制剂(zVAD)的情况下,用S25D突变来恢复pS25 RIPK1极大保护了BMDM和MEF,使它们免受TNF诱导的RIPK1激酶依赖性细胞凋亡和坏死性凋亡(图1)。

研究人员之前发现,将IKKi与亚致死剂量的TNF一起给药会导致小鼠体温过低和死亡。值得注意的是,Ripk1S25D/+和Ripk1S25D/S25D小鼠能够躲过这种致命的攻击。在没有IKKi的情况下,注射致死剂量的TNF,这些小鼠也同样受到保护。总之,这些结果强调了IKKα/β介导的pS25 RIPK1在体外和体内都具有重要保护作用,能够避免TNF诱导的细胞死亡。

Nature子刊:RIPK1如何在双面角色中切换?

图1. 模拟Ser25磷酸化避免TNF诱导的细胞死亡

Ser25磷酸化调节了Yersinia感染后的免疫反应

Yersinia感染小鼠是一种常用的模型。在耶尔森菌属Yersinia感染细胞后,毒力蛋白YopJ/P抑制了IKK和TAK1的催化活性,试图通过阻止促炎症介质的表达来逃避宿主防御。为了应对这种劫持,RIPK1激酶依赖性细胞凋亡已成为一种备用机制,以帮助宿主细胞应对感染。

研究人员分析后发现,在Y. enterocolitica(表达YopP)和Y. pseudotuberculosis(表达YopJ)感染细胞后,模拟pS25 RIPK1的BMDM能够免受YopJ/P依赖性细胞凋亡。在Ripk1S25D/S25D BMDM中观察到的保护作用与药理上或遗传上抑制RIPK1激酶活性的效果相当。这些结果表明,YopP/J对RIPK1 Ser25磷酸化的抑制激活了应对Yersinia感染的备用机制,也就是RIPK1激酶依赖性细胞死亡。

Ser25磷酸化缺陷导致多器官炎症

在另一种SHARPIN缺陷型小鼠模型中,RIPK1激酶依赖性细胞死亡却发挥着有害作用。小鼠慢性增生性皮炎(cpdm)是一种因缺乏SHARPIN表达而出现的多器官炎性疾病,它诱导了TNF/TNFR1介导的RIPK1激酶依赖性细胞凋亡或坏死性凋亡。

鉴于SHARPIN在IKKα/β激活中起作用,研究人员从SHARPIN缺陷型小鼠(Shpncpdm / cpdm)中分离出小鼠皮肤成纤维细胞(MDF),发现TNF诱导的pS25 RIPK1存在缺陷。之后,他们用S25D突变来恢复Ser25磷酸化,发现这能够保护细胞免受TNF诱导的细胞凋亡。更重要的是,将Ripk1S25D / S25D小鼠与Shpncpdm / cpdm小鼠杂交完全拯救了后者的多器官炎症表型(图2)。

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图2. Ser25磷酸化缺陷导致多器官炎症

Ser25磷酸化直接抑制了RIPK1催化活性

研究人员通过结构分析发现,Ser25位于RIPK1 β1-β2发夹内的激酶结构域,紧邻着ATP结合位点中的富含甘氨酸环,这是蛋白激酶中最保守的motif之一。他们预计Ser25的磷酸化会影响核苷酸结合。利用重组RIPK1开展激酶分析后,他们发现S25D模拟磷酸化突变极大地影响了RIPK1的激酶活性。因此,在细胞表面受体结合期间,Ser25的磷酸化似乎直接抑制了RIPK1的催化活性(图3)。

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图3. Ser25磷酸化直接抑制了RIPK1催化活性

研究人员在文中总结道:“在本研究中,我们揭示了IKKα/β对RIPK1上Ser25的磷酸化作为分子刹车,直接抑制了RIPK1的激酶活性,这有助于了解对炎性细胞死亡的调控,并有望成为药理学干预的靶点。”

原文检索

Serine 25 phosphorylation inhibits RIPK1 kinase-dependent cell death in models of infection and inflammation

Nature Communications 10, Article number: 1729 (2019)



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