SHIELD—新一代组织透明化及免疫荧光标记解决方案

来源: 锘海生物科学仪器(上海)股份有限公司   2019-6-19   访问量:1333评论(0)

自2013年CLARITY组织透明化方法诞生以来,完整生物大组织的透明、荧光标记和成像已成为生命科学领域一个热门的议题。许多科研工作者致力于探索和改进各种透明化方法(如iDISCO(2014)、uDISCO(2016)、PEGASOS(2018)等油性透明化方法,以及CUBIC(2014)、PACT(2014)、ScalsS(2015)、Ce3D(2017)等水性透明化方法)以期获得一套全组织高分辨率(至少细胞级分辨率)成像的解决方案,专门用于探索神经、血管等大尺度结构在完整脑、心肝脾肺肾、肿瘤、骨骼中的3D精准定位和测量。

麻省理工Dr. Kwanghun Chung(CLARITY方法的第一作者)课题组也一直在尝试对CLARITY方法进行改进,如Stochastic electrotransport(2015)用于改善CLARITY-ETC装置在透明样品时,样品形变问题以及免疫染色速度慢的问题;SWITCH(2015)用于改善组织固定不均匀以及染色不均匀的问题;MAP(2016)用于主动膨大样品,将亚细胞结构(树突棘、突触)放大到普通荧光显微镜(共聚焦)可观察的分辨率。如今Dr.Chung课题组又添新方法SHIELD(2018)。

SHIELD几乎是从源头上对CLARITY进行了改进。作者从蛋白质构象保护出发,从上百种化学试剂中筛选出了P3PE,它对组织的环氧化作用使其在组织荧光保护、内源性蛋白质和RNA结构保护、降低自发荧光等方面表现出非常优异的性能,所以SHIELD方法完全摒弃了原有的丙烯酰胺固定,选用P3PE作为固定剂,同时也摒弃了丙烯酰胺凝胶包埋的步骤,固定完的样品无需包埋,可直接进行SDS透明化。

来看下SHIELD的表现吧

SHIELD对荧光蛋白的保护

无论是EGFP,YFP还是tdTomato,P3PE对荧光的保存胜过PFA,GA, THE,BABB,MeOH等其他透明化方法所采用的试剂。



SHIELD对内源性蛋白的保护

作者测试了53种抗体,SHIELD表现出了与传统PFA固定方法一样优异的结果,荧光信号远胜于CLARITY。



SHIELD对核酸的保护

作者比较了不同固定方法以及组织内不同mRNA的FISH(荧光原位杂交)结果,SHIELD很好的保存了组织的核酸结构。



SHIELD降低了组织的自发荧光

背景荧光的降低对于荧光成像来说,一定是个福音,要想获得好的图像,一定要有足够的信噪比。如果单纯的把成像结果不好归因于结构信号不强那就大错特错了,结构信号不强时,如果背景足够弱,同样也是可以清晰的看到结构。



SHIELD组织具有媲美油性透明化方法的机械强度

做过透明化的研究者们一定会为水溶性透明化方法处理之后样品的软化程度所苦恼,它不仅使得样品在操作过程中需要小心翼翼,成像过程中样品也非常难以固定。SHIELD样品具有一定的机械强度,可以经受住镊子,药品匙,样品架等的摧残。



SHIELD结合SWITCH的多轮免疫荧光染色

当然SHIELD的作者也不忘结合之前的优秀方法,将SHIELD的应用进一步扩大,比如结合SWITCH(2015)进行多次免疫荧光染色,对同一个样品进行多种结构的探索。



SHIELD结合MAP的亚细胞精细结构探索

结合了MAP(2016)的SHIELD,可以看到树突棘的结构,可以追踪整根神经的分布情况。



临床活检样品的检测

这么多的优势最终也是希望能更好的运用在临床样品中。SHIELD在结合了Stochastic electrotransport(2015)以后,可在4小时内完成临床样品(intact needle biopsies)的透明及染色。

临床脑活检样品


小鼠肾活检样品(乳腺癌转移)



Dr. Chung课题组的成果已逐步在LifeCanvas Technologies公司实现商业化(由锘海生物代理)。

SHIELD固定剂


Smartclear Pro II


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