干货 | FFPE样本提取方法/效率比较

来源: 菁良基因科技(深圳)有限公司   2019-6-28   访问量:3997评论(0)

从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织中分离基因组DNA是分子诊断分析的关键步骤。必须从FFPE组织中回收最大量的DNA,且其质量足以进行必要的分子诊断分析(如qPCRsanger测序、NGS测序等)。

为了研究哪种DNA提取试剂盒能够从较低细胞数量的样本中回收较多的DNA产量和较高的浓度,研究者用同一个FFPE蜡块上连续切片的蜡片为样本,并使用五种不同试剂盒从FFPE蜡片中提取DNA
Promega Maxwell® 16 FFPE Tissue LEV DNA Purification Kit
Promega MagneSil® Genomic, Fixed Tissue System Kit
Promega ReliaPrep FFPE gDNA Miniprep System

Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit
Roche Cobas® Sample Preparation Kit


细胞系来源均一的FFPE样本

培养的KRASG12D/+SW48细胞,使用福尔马林固定、进行石蜡包埋并制成蜡块。从FFPE蜡块上切下10μm的切片,每个蜡片约含有100000个细胞。每种DNA提取试剂盒分别提取6个蜡片。关于蜡片均一度,详见FFPE生产工艺质检标准及结果。

所有提取均按照试剂盒的说明书进行。根据试剂盒的说明,使用Promega QuantiFloorDS检测DNA回收率。


不同提取试剂盒的DNA产量分析

1显示了使用Maxwell®Magnesil®ReliaPrep®DneEasyCobas®试剂盒各提取六个FFPE蜡片回收的DNA平均量。使用自动化的Promega Maxwell®平台回收的DNA质量最多。


图一.五种DNA提取方法各提取6片FFPE蜡片,获得的平均DNA产量(误差线表示标准偏差)。

不同提取试剂盒的回收的DNA浓度比较

2显示了分别使用Maxwell®Magnesil®ReliaPrep®DneEasyCobas®试剂盒各提取六个FFPE蜡片回收的平均DNA浓度。手动Promega Magnesil®平台回收的DNA浓度最高。


2.使用五种不同的DNA提取方法,各提取六个FFPE蜡片,提取的平均DNA浓度。误差线表示标准偏差。

不同提取试剂盒的工作时间比较

尽管这五种不同的试剂盒分别处理六个样品的操作时间(2-3小时)非常相似(不包括DNeasy方法进行蛋白酶k过夜的步骤),但自动化的Maxwell®平台进行更大的样品数量处理时明显优于手动方法。图3显示了使用五种方法分别处理32FFPE样本所需的理论时间和实际操作时间。Maxwell®方法的理论时间和实际操作时间明显短于手动方法。



3.使用五种不同的DNA提取方法分别处理32FFPE样本的理论时间(左)和实际操作时间(右)。

结论
菁良的参考标准品为这些比较研究提供了理想材料。菁良的FFPE标准品在生产过程确保每个部分均包含相同的细胞数,因此可回收相似的DNA量(详见FFPE生产工艺质检标准及结果)。

使用定制的低细胞数量的FFPE蜡块进行比较研究,我们发现Promega Maxwell® 16 FFPE Tissue LEV DNA Purification Kit,是从FFPE样品中提取基因组DNA的首选方法。这种方法可以回收最高产量和最高纯度的样品DNA。额外节省的时间对于我们FFPE标准品目录产品和本研究中使用的定制标准品的质量控制至关重要。

Maxwell®平台的另一个优势是降低了污染风险,这对于我们生产的质量控制至关重要。作为FFPE标准品的补充,我们还提供提取好的基因组DNA参考标准。交叉污染的风险必须控制并降低到绝对最小,我们评估的最佳的提取方法是Promega Maxwell®平台配套的Promega Maxwell® 16 FFPE Tissue LEV DNA Purification Kit进行FFPE样本提取。




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