如何选择湿转移与半干转移?

来源: Cell Signaling Technology,Inc(China)   2019-7-8   访问量:1635评论(0)

当做蛋白印迹实验(WB)检测靶标蛋白时,对于多数人而言,蛋白裂解物经过SDS-PAGE 电泳分离后,大家一般是看到实验室哪台装置正好可以用,基本就决定用它进行转膜了,接着就是去考虑怎么优化转膜条件达到最佳的检测结果。


 

却很少有人会纠结,我们实验室为什么配备的是湿转移装置或半干转装置?两者到底如何选择呢?

 

湿转与半干转的区别

在半干转移中,夹心结构直接放在正电极和负电极之间。在湿转移中,夹心结构放在正电极和负电极之间,并浸泡在应用了电场的转移缓冲液中。

两种转移方法的摆放顺序是:

半干转移: 纸 > 凝胶 > 膜 > 纸(均用转移缓冲液浸湿)

 

湿转移: 海绵 > 纸 > 凝胶 > 膜 > 纸 > 海绵(全程在转移缓冲液浸泡

 

湿转与半干转的选择

根据常规的实验室知识,湿转移能更好地将蛋白从凝胶上转移成为印迹。如果转移过程中出现干膜会导致实验的失败,湿转移因为本身的特点,很容易就规避这样的风险,所以,对于需要加长时间进行转移的大蛋白而言,湿转移更适合。

 

而半干转移技术优点则体现在更快地完成转移,消耗的缓冲液少,同时,对于做实验比较挑剔的人而言,他们觉得半干转的流程也会相对干净。

 

在很大程度上,决定使用湿转移还是半干转移还与使用的膜的类型有关。虽然许多人认为硝化纤维(NC)膜和聚偏二氟乙烯膜(PVDF)可以在很大程度上互换,但其实两者存在一些差异。PVDF 通过疏水相互作用来结合蛋白,而硝化纤维则同时通过疏水和静电两方面相互作用来结合蛋白。因此,对于必须要求绝对最高转移水平的人来说,湿转移到 NC 膜上可能是最好的办法。但就速度和易用性而言,半干转移通常更能接近一般用途标准。

 

 

选择好转移方法后,也要切记根据自己的靶标蛋白进行转移优化。

 

转移优化小贴士

  1. 在湿转过程中,把较大的蛋白从凝胶转移到膜的速度较慢,因此可以根据目的蛋白大小来考虑延长转移时间。同时,CST 建议用转移缓冲液将甲醇的浓度降低至 5-10%,也可以考虑在转膜缓冲液里加入0.1% SDS。

     

  2. 孔径是影响转移效果的一个重要因素,市面上NC膜和PVDF膜都有可用于各种孔径的类型,根据靶标蛋白来选择。

     

  3. 一些厂家建议,在封闭前先将膜风干,然后用甲醇再次浸湿,这样能增强与转移蛋白的结合,还能降低背景。这个脱水步骤的原理是可以去除变性蛋白与膜之间的水分。在特殊和困难情况下可以用多聚甲醛(Preterre 等)固定膜,以提高蛋白存留率。

 

 

好啦,希望在你凝神斟酌是使用湿转移还是半干转移时,你的蛋白没有从凝胶上流走一星半点!

 

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