Iso-seq经典文献丨标准分析如何收获 IF4.1?

来源: 安诺基因   2019-7-10   访问量:1522评论(0)

化疗耐药性是乳腺癌治疗过程中一道难以攻克的难题。近年来,越来越多的研究表明一些可变剪切事件和转录本的功能会影响癌症的发生、发展、转移以及耐药性。日前,复旦大学附属肿瘤医院上海医学院在线发表了一篇乳腺癌的最新研究进展,研究中发挥了PacBio SMRT测序技术在鉴定可变剪切与新转录本方面的优势,揭示了紫杉醇耐药型三阴乳腺癌的治疗新靶点。


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全长转录组测序(Iso-seq)揭示紫杉醇耐药型三阴乳腺癌的新靶点


​发表时间


2019年4月


样本选择


野生型(231-WT)和紫杉醇耐药型(231-PTX)人类三阴性乳腺癌细胞MDA-MBA-231


实验设计


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主要结果


1. Iso-seq测序结果总览

研究人员对野生型和耐药型的乳腺癌细胞进行了SMRT测序,经转录本校正和去冗余后,分别获得了26,268和23,784条高质量的全长转录本,其中3-4 kb的转录本占比最多,与RNA-seq相比,Iso-seq具有明显的读长优势(图1C,D)。

 

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图1 Iso-seq测序结果总览[1]


2. 可变剪切分析

基于Iso-seq的结果,在野生型和耐药型细胞中共获得48,646个可变剪切(AS)事件,其中外显子跳跃(SE)类型所占比例最高。在所有AS事件中,仅11.11%在参考基因组中已注释,表明在三阴乳腺癌的耐药性发展过程中有大量AS事件产生(图2A)。AS事件的组成在野生型和耐药型细胞中保持一致,表明在紫杉醇耐药性发展的过程中AS事件的模式没有发生变化(图2B),但超过90%的AS事件表现出样品特异性,因此每个AS类型的事件都发生了巨大的变化(图2C)。此外,Iso-seq结果中90%的可变剪切位点有RNA-seq数据支持,表明Iso-seq测序在鉴定可变剪切事件中的高准确度


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图2 可变剪切分析[1]


3. 诱导耐药性产生的新isoform

随后研究人员对耐药型乳腺癌细胞中新发现的isoform及其显著性进行了探究。新isoform共6,130条,其中2,509条有RNA-seq的结果支持并用于进一步分析(图3A)。与已注释的isoform相比,新isoform的平均表达水平更高(图3B),且新isoform中差异表达基因所占比例也更高(图3C)。因此,与野生型乳腺癌细胞相比,耐药型细胞的新isoform有更强烈的改变。之后研究人员对新isoform有差异表达但已注释isoform无差异的基因进行了分析,共得到11个基因,仅METTL15在基因水平出现了明显的表达差异(图3D),而其他基因在基因水平无明显变化,表明对转录本进行精确分析的必要性


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图3 新isoform分[1]


4. 紫杉醇敏感性潜在biomarker BAK1

研究人员从上表的11个基因中挑选了BAK1 进行验证,此前有研究报道过BAK1 在肿瘤生长和药物敏感性方面的作用,但缺少在乳腺癌方面的相关研究。通过比较野生型和耐药型细胞,发现BAK1在基因水平的表达没有明显差异;在转录本水平,新isoform PB.4024.2在耐药型细胞中呈3倍显著下调,其它已注释isoform没有显著变化(图4A,B)。之后作者对PB.4024.2的表达进行了qPCR等验证,表明它可作为紫杉醇治疗的潜在biomarker(图4C,D)。BAK1 的转录本模型显示内含子保留可能是引起isoform出现差异分化的原因(图4E)。


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图4 BAK1基因表达分析与验证[1]

 

小结


 

本文利用PacBio测序的结果探究了野生型和紫杉醇耐药型三阴乳腺癌细胞中发生的可变剪切事件,及耐药性发展过程中新出现的isoform,发现PB.4024.2可作为三阴乳腺癌潜在的耐药biomarker,为研究癌症的耐药性提供了新思路。 

 

值得注意的是,研究中仅用到了全长转录组的部分标准分析内容,便收获一篇IF=4.1的文章,可谓对症下药,事半功倍。除可变剪切与新转录本外,Iso-seq在癌症领域的主要应用还包括发现融合基因、癌症驱动基因的结构变异等,为研究癌症的致病机制、耐药性和治疗方法等提供有效手段。


小贴士

 

目前利用Sequel II平台进行Iso-seq测序,在疾病研究方面,如欲获得单一病变组织或细胞的全长转录组数据,通常建议设置患病与正常组(或癌症与癌旁组织),每样本不低于40 G测序数据量;如需深入探究可变剪切、融合基因等结构变异,则通常建议50-80 G测序数据量,相当于使用3-4个Sequel SMRT cell。


 

参考文献:

[1] Lian Bi., Hu Xin., Shao Zhi-Ming., (2019). Unveiling novel targets of paclitaxel resistance by single molecule long-read RNA sequencing in breast cancer., Sci Rep, 9, 6032.



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