IHC免疫组化实验垃圾和分类知多少?

来源: 北京索莱宝科技有限公司   2019-8-15   访问量:1256评论(0)

实验室的垃圾分类

Western blot    IHC

      

          众所周知,Western blot(WB)和免疫组化(IHC)都属于免疫学常用的实验技术。WB是通过SDS-PAGE分离蛋白质样品,然后转移到固相载体上,利用抗原与抗体特异性结合的原理进行样品检测,可用于定性和半定量。而IHC是融合了免疫学原理(抗原抗体特异性结合)和组织学技术(组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等),通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素)显色,对组织(细胞)内抗原进行定位、定性及通过Image J进行定量的研究(主要是定位)。与WB相比,IHC实验步骤复杂,涉及的试剂和物品种类繁多,所以IHC的垃圾分类更要认真对待。那么,IHC实验中的垃圾到底有哪些?又该如何分类呢?索莱宝从IHC的实验步骤开始和大家逐一叙述。

 


IHC(石蜡切片)都有哪些步骤


一、 石蜡组织切片制作

  1. 固定:使组织样本尽量保持其离体前状态,多采用4%多聚甲醛固定液。

  2. 脱水:水和透明剂不能互溶,只有脱去水分后,才能让透明剂进入。使用梯度乙醇进行脱水。75%、85%、95%、100%、100%乙醇,每步1h-2h左右。

  3. 透明:乙醇不能与石蜡相溶,还需用能与乙醇和石蜡相溶的媒浸液,替换出组织内的乙醇。二甲苯是常用的透明剂,可以很好地与石蜡互溶。将组织依次放入二甲苯与无水乙醇的等体积混合液、纯二甲苯和纯二甲苯中进行透明。

  4. 浸蜡与包埋:用石蜡取代透明剂,使石蜡浸入组织而起支持作用,便于在切片机上夹持切片。用于包埋石蜡的熔点在50~60℃之间。

  5. 切片:将包埋组织的蜡块固定在切片机上,切片厚度一般为4~8μM。

  6. 贴片:把切片放入50℃水中,摊平后用多聚赖氨酸处理过的载玻片捞起,室温晾干。


二、 脱蜡复水

  1. 干燥后的切片需脱蜡及复水才能在水溶性染液中进行染色。如果不经过复水,直接进入染色剂中,材料将会严重变形,甚至难以染色。
  2. 先烤片,将切片放于60℃烘箱中烘烤。

  3. 二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各10~15min。

  4. 放入100%、100%、95%、85%、75%等梯度乙醇溶液中各3min。

  5. 放入蒸馏水洗两次×5min。PBS(或PBST)洗三次×3 min。


三、 抗原修复

  1. 甲醛的固定使细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇,同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。在染色前需进行抗原修复或暴露。
  2. 将切片浸入0.01M柠檬酸盐缓冲液中,再放入微波炉中加热10 min,之后冷却切片。或者,用EDTA-胰蛋白酶消化液37℃消化10 min。

  3. PBS(或PBST)洗三次×3 min。用吸水纸将切片组织周围擦干。


四、 灭活内源性过氧化氢酶

  1. 去除组织中的内源性酶催化底物,避免染色的非特异性。
  2. 用免疫组化笔圈出样品,滴加3%过氧化氢溶液孵育10min。

  3. PBS(或PBST)洗三次×3 min。


五、 封闭

  1. 为减少背景产生的非特异性染色,使用非免疫动物血清进行封闭。
  2. 滴加动物血清封闭液,室温封闭30min。

  3. 甩去多余液体,用吸水纸将切片组织周围擦干。


六、 抗体结合

  1. 滴加一抗,4℃孵育过夜。

  2. PBS(或PBST)洗三次×3 min。

  3. 滴加辣根酶标记的二抗,37℃孵育30min。

  4. PBS(或PBST)洗三次×3 min。


七、 底物显色

DAB显色5-10min,在显微镜下掌握染色程度,然后PBS或自来水冲洗1min。


八、 复染

  1. 衬托出组织细胞的形态结构,更好地对目标蛋白进行定位。
  2. 苏木素复染1-3min。

  3. PBS或自来水冲洗1min。


九、 分化

1%的盐酸酒精分化2~3秒,PBS或自来水冲洗两次×5min。


十、 脱水和透明

  1. 75%,85%,95%,100%,100%的乙醇浸泡各2min。

  2. 二甲苯浸泡两次×2min。


十一、 封片

用盖玻片和中性树胶进行封片。之后镜检。




IHC(冰冻切片)实验怎么做


一、冰冻

将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内(直径约2cm),如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织,然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内,当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾,此时小盒保持原位切勿浸入液氮中,大约10-20s组织即迅速冰结成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱贮存备用,或置入恒冷箱切片机冰冻切片。

注意:针对储存在-80℃温度下的组织,切片前,从冷冻柜中取出组织样品,在-20℃的温度下均衡约15分钟。这样可以防止切片在封闭时破裂。


二、切片

用OCT包埋剂浸没组织。将组织切成厚度在6-8μm之间的切片,置于多聚赖氨酸粘附的载玻片上。固定前,将切片放置在工作台上风干几分钟(这样可以增加切片的粘附作用)。


三、固定

选择适宜的固定剂,可采用丙酮固定,-20℃下冷冻10分钟,风干。

之后,同上面实验步骤:灭活内源性过氧化氢酶→封闭→抗体结合→底物显色→复染→分化→脱水透明→封片→镜检。





IHC实验垃圾怎么分类


有机废液

无机废液

感染性废固

置锐器盒

乙醇

丙酮

二甲苯

中性树胶

DAB显色液

1%的盐酸酒精

多聚甲醛固定液

苏木素染色液

柠檬酸盐缓冲液

EDTA-胰蛋白酶消化液

PBS

过氧化氢溶液

枪头

石蜡

湿盒

吸水纸

染色缸

染色架

切片盒

免疫组化笔

抗原修复盒

凝固的OCT包埋剂

废刀片

载玻片

盖玻片

备注:根据情况可进行相应的消毒灭菌后,再装入对应颜色的垃圾袋中,交给有资质的公司,统一回收,进行无害化处理。


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