博士狗PCR秘籍大放送

来源: 上海吉凯基因化学技术有限公司   2019-8-20   访问量:1901评论(0)

博士狗PCR秘籍大放送

1.提高退火温度——针对序列长、相似度高、GC%高的模板

引物是用来与模板互补结合后退火用来延伸的“引子”,延伸方向是5’到3’方向。


1.1 3’端一定是有G和C的,毕竟人家三个氢键,连接更紧密。5’连接不紧密问题不大,毕竟新碱基单体加入是从3’端进行的。

1.2 思想要解放!别太固守“退火温度要在55℃到65℃之间”这种老观念。本胖儿从35℃到85℃,全部做过!【变性98℃-退火60℃-延伸72℃】这个循环大部分都可以简化为【变性98℃-延伸72℃】。

1.3 我的建议是,大部分通过PCR扩增基因,可以尝试将引物设计的更长一些,将引物的退火温度设定在72℃,甚至更高,例如80℃以上!直接使用【变性98℃-延伸72℃】大约30个循环的程序来扩增。特别对于短重复序列多,GC含量高,片段长的情况,比较适宜采用这种办法!能够有效降低非特异扩增的发生概率。



2.体系中添加温和活性剂——针对非特异扩增多、GC%高的模板

2.1 PCR扩增体系中可以加入甜菜碱等添加剂,实现大幅降低非特异扩增比例。

甜菜碱的效果,我们用的最简单粗暴的方法来确定,直接Sanger测序,结果已用聚类软件进行分析。


HTT表示亨廷顿舞蹈症的致病三核苷酸重复片段。

0.8MBetaine表示反应体系中甜菜碱(Betaine)终浓度为0.8mol/L。

图中可以明显看出,随甜菜碱浓度的提高,扩增的准确性也逐渐提高,序列比对一致性显著增加。反应体系中甜菜碱在2M浓度以上时,几乎不存在非特异扩增。

2.2 甜菜碱作用原理

甜菜碱者,温和的离子型表面活性剂也。

易溶于水,具有较高渗透性,工业用途中常用作乳化剂,分散剂,性质稳定。

特异性扩增本底就强于非特异扩增,因此当甜菜碱均质的分散在PCR扩增体系中,给PCR扩增酶施以轻微的阻力时,特异性扩增与非特异扩增均受到抑制,但是由于非特异扩增本身能力较弱,所以受到的抑制效果就更大,就将非特异扩增会消耗的dNTP,离子和底物更多的提供给特异扩增,结果就是特异扩增在整个反应体系中所占比例显著上升。

2.3 还有啥可以代替甜菜碱?

有!甘油可以,浓度比甜菜碱略高;DMSO可以,浓度要比甜菜碱低不少。都属于温和的PCR扩增抑制剂。

还有!甲酰胺可以,浓度极低。不过!!!要注意,甲酰胺属于很强的DNA变性剂且对人体有神经毒性!所以强烈不建议使用。题外话……Sanger测序上机前最后一步,将PCR产物全部游离成为单链DNA的HiDi,就是溶解于Tris里面的甲酰胺。



3.PCR仪修改程序

3.1 缓慢降温

诚然,一般PCR反应,使用默认降温速度是可以满足需求的。然而,对于序列复杂,相似程度高,GC含量高,乃至三核苷酸串联重复多,此种类型的模板,本胖儿的建议是,将变性到退火这一段的降温速度,调整到5秒一度,乃至更慢。引物与模板的结合,是错配以恒定概率发生的事件,并且,结合与解离过程是同时发生的。温度降低的快,引物与模板结合的就快,解离的慢,因此发生的错配就容易被固定下来。温度降低的慢,引物与模板结合的慢,解离也在慢慢发生,引物与模板就能够“逐渐磨合”到一个空间位阻最低的相互结合的位置,就是最佳的匹配结合位置。

3.2 TouchDown大法

TouchDown又称为降落PCR。

原理是温度高时发生的特异性扩增多,温度低是发生的非特异扩增逐步增加。因此退火温度从高温到低温,随循环数逐步降低,最初循环中发生的主要是特异性扩增。后面随温度降低,即使非特异扩增与特异扩增以相同概率发生,但是由于起始循环中特异性扩增产物较多,后续扩增中,特异性扩增产物的积累速度也是远大于非特异扩增的。

例如一个PCR程序为30个循环,最初第一个循环中退火温度为65℃,每个循环降低0.5℃,那么程序后面循环的退火温度为64.5℃、64℃、63.5℃、…………52℃、51.5℃、51℃、50.5℃。

理想的扩增曲线如下图所示:

小技巧:退火温度设定范围建议是从(TM+5)℃ 逐步降温至(TM-5)℃。



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