靶向蛋白组学定量(MRM/SMR,PRM)和SWATH技术

来源: 北京安必奇生物科技有限公司   2019-9-2   访问量:1680评论(0)

上一篇中,我们介绍了非靶向蛋白组学定量技术,这期,我们来认识下靶向蛋白组学定量技术都有哪些呢?以及什么是SWATH技术?


靶向蛋白组学定量

非靶向蛋白组学定量技术受限于生物样本的复杂性,低丰度的多肽信号容易被高丰度的所抑制,因此难以检测低丰度的多肽,灵敏度低且具有随机性,定量的重复性也较低。随着蛋白组学研究的深入,差异蛋白组学越来越受到人们的青睐,差异蛋白分析能发现潜在疾病标志物,加快代谢组学的临床应用步伐。靶向蛋白组学定量(又被称为目标蛋白组学定量)技术可以弥补上述非靶向定量组学定量的不足,具有高通量、高准确性、可重复性的优点,基于早期的差异蛋白组/转录组/基因组的数据,在大生物样本量中,验证这些标志物。靶向蛋白组学定量主要包括MRM/SMR和PRM。靶向蛋白组学定量技术可用于信号传导通路检测、肿瘤标志物研究和翻译后修饰研究,是基于抗体的蛋白定量技术以外的另一种快速、高效蛋白靶向定量技术。

01 MRM/SRM

多重反应监测技术(multiple reaction monitoring, MRM)在早期文献中又被称为选择反应监测技术(selected reaction monitoring,SRM)。该技术本质上是一种质谱的扫描模式,基于目标蛋白的特定母离子和子离子对,选择采集符合目标离子规则的信号,去除不符合规则的信号干扰,进行高灵敏度、高准确性和特异性的靶向蛋白定量。MRM质谱分析主要包括三个阶段:(1)一级质谱扫描筛选出与目标分子特异性一致的母离子;(2)碰撞碎裂母离子,去除干扰离子;(3)只采集来自选定的特异离子的质谱信号。可以基于理论预测(如MRMpilot等软件)或者真是实验结果选择母子离子对。

图1. 三重四极杆质谱仪进行MRM扫描示意图。

该技术最大限度排除了其他离子的干扰影响,显著提高了靶向肽段的信噪比和对目标肽段定性和定量检测的灵敏度和可重复性,被认为是基于质谱技术的蛋白定量的“金标准”,特别适合进行标志蛋白的高通量监控。通过在样本中加入已知含量的同位素标记肽段作为内参,MRM技术还可用于目标蛋白的绝对定量。MRM技术可以和多种定量策略联用,蛋白组学实验通常包含大量的分离富集步骤,因此越早加入内标能更好的降低实验误差。另外MRM适合多种质谱仪,如高分辨率质谱仪(Q-TOF,orbitrap, FT-ICR,能区分ppm级别的质量差异)和低分辨率质谱仪如三重四极杆质谱仪。

02 PRM

平行反应监测技术(parallel reaction monitoring, PRM)是MRM的衍生技术,也可在复杂生物样品中同时对多个目标蛋白进行相对或者绝对定量检测。PRM采集目标肽段的高分辨率MS2质谱图,使用软件对ppm级别的目标离子进行峰面积抽提,有效排除其他离子的干扰。与MRM相比,动态范围更广,精度更高灵敏度更强,重复性更好,抗背景干扰能力更强,实际操作更简单,成本更低。PRM不需要预先根据目标蛋白设计母离子和子离子对,实现了对子离子的全扫描。PRM可替代Western blot技术,高通量地在大生物样本量中验证抗体,并可应用于多种非模式生物。

PRM主要包括五个实验流程:(1)从shotgun实验或者根据理论推测选择靶向肽段;(2)制备样品的混合物;(3)预实验调整参数和靶向肽段;(4)PRM检测;(5)数据分析。PRM方法的不足之处是当待分析肽段的数量过大时,需要精细调整质谱采集参数,否则会大大影响定量数据的准确和精度。2015年,Gallien和同事设计了一种内标触发平行反应监测技术(Internal standard triggered-parallel reaction monitoring,IS-PRM),通过添加内标和实时调整采集参数来定量内源肽段,即使在分析大量肽段数据时也可使质谱结果始终保持高精准状态。

图2. SRM/MRM和PRM的实验流程对比图。

SWATH/DIA

iTRAQ/TMT,SILAC,label free等蛋白定量方法都是基于数据依赖型采集(data-dependent acquisition,DDA)技术,即二级质谱只能采集一级谱图中信号最强的top20,而在母离子选择时,质谱偏向于扫描高丰度肽段。SWATH是一种新的质谱采集模式技术,它把数据非依赖采集(datain-dependent acquisition, DIA)和高分辨的靶向质谱数据提取相结合,能对目标蛋白进行检测和定量。SWATH在DIA模式下,能够将特定质量范围内的所有前体离子打碎,采集所有碎片离子,并依次超高速扫描相邻的母离子宽口内的所有碎片离子,获得完整的肽段信息。

图3. DDA、DIA和MRM的原理比较图(DIA:随机采集模式)。

一次SWATH实验就能获得完整的蛋白定量和定性结果,无需方法优化。高分辨率的模式可以消除背景干扰,提高选择能力、灵敏度和通量,针对亚细胞结构、微生物、细胞分泌物等样本,SWATH的定量效果非常好。SWATH采集模式,不同于 MRM需要在数据采集前对目标肽段做方法开发,它可以直接采集数据,形成的电子文档,方便今后随时根据实验需求挖掘更多的信息。利用免费(OpenSWATH24, Skyline25, PeakView)或者商用的软件(Spectronaut)和蛋白组特定的方法库,SWATH可以完全媲美 MRM 技术,并大大提高定量通量。SWATH主要应用于蛋白质组定量、蛋白复合体鉴定和宿主蛋白分析等


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蛋白质定量组学

MMR

SWATH

参考文献

1. 基于质谱的定量蛋白质组学技术发展现状[J]. 生物技术通报, 2017(9).

2. Rosenberger G , Koh C C , Guo T , et al. A repository of assays to quantify 10,000 human proteins by SWATH-MS[J]. Scientific Data, 2014, 1:140031.

3. 章申燕. mTRAQ/MRM定量技术在AKR家族分析中的应用[D]. 2013.

转载自公众号:北京安必奇生物科技有限公司
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