【知道】验证可以很简单?组学大牛的选择抓紧了解一下

来源: 上海中科新生命生物科技有限公司   2019-10-9   访问量:795评论(0)

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上期【知道】,跟各位老师分享了非靶向蛋白质组学技术的热门新技术—DIA。本期,我们将视线从上游转移到下游,跟大家聊聊靶向定量蛋白质技术——PRMParallel Reaction Monitoring)。

为什么特别关注靶向蛋白技术?因为目前蛋白质组发表文章的要求,已形成了明确的趋势,即“做完组学不验证,reviewer不发通行证”。而靶向蛋白检测技术如PRM,是目前组学结果验证技术中,应用关注度最高的。

虽然发文章不是本期的核心主题,但是小编认为,我们有必要先聊聊蛋白组结果验证的那些事。作为15年蛋白组老司机,上百篇项目文章的经验明确告诉我们:早些年,蛋白质组的结果验证是文章高配;这些年,蛋白质组结果验证已逐渐变为标配。甚至我们还遇到过:杂志主动约稿的稿件被审稿人退回,要求用靶向技术对定量结果进行验证。在我们苦口婆心建议各位老师做验证的背后,是一个个悲惨的故事。不少研究者抱有侥幸心理:先投稿,如果审稿人要求验证,再回头补。而现实结果往往是:稿件中对某些“重要的”差异表达蛋白进行了“充分”的阐述和意义描述,但最后在revision补实验的结果中,该蛋白并没有差异表达,这就是传说中的釜底抽薪feel没错了。所以,蛋白质组的结果验证要做在前面,事后再补的风险很大。可能,很多老师有自己的委屈:研究的物种、蛋白没有好的抗体,没法做WB;而PCR只能验证mRNA水平,转录水平有时与蛋白水平并不一致。诚然,放在以前,这是好用的回复套路。但现在用这些理由说服reviewer,已经行不通了,因为基于质谱的靶向检测技术,几乎解决了这个问题。

关于靶向质谱的技术介绍应用,以及跟抗体法的比较等等,在此不做赘述。感兴趣的老师,强烈推荐翻阅本公众号之前的这篇文章:新神器来袭:《PRM技术——蛋白质组学验证,无缝对接!!》(https://mp.weixin.qq.com/s/rr5Q69lVLR9dR5P00qVOnw。这里只给大家回顾一个关键信息,往下看:

这是一篇前几年发表于《Molecular & Cellular Proteomics》(下文简称MCP)的Editorial作者是《MCP》的正、副主编。这几年,我们看到的很多审稿意见中,不少审稿人对验证实验要求的描述,直接就是说:“one suggestion is that PRM or MRM based targeted proteomic strategy should be used for validation”“validate the expression levels of XX proteins discussed in the manuscript by using MRM/PRM assays”。两者之间的联系和含义,相信无需笔者多说。

关于验证必要性的问题,我们先谈到这里。回到本期主题,如何利用靶向质谱技术—PRM来轻松愉快地进行蛋白组学的验证呢?PRM技术是近几年靶向质谱技术的热门,从蛋白质组结果验证到非组学目标的靶向检测,从基础研究再到临床治疗与诊断,都被广泛接受和应用。大有超越经典技术SRM/MRM之势(PRM技术优势见上述推荐文章)。

PRM技术应用的高歌猛进毫无悬念,而作为国内最早开展PRM技术、PRM文章发表最多的平台,我们更关注的却是PRM火爆应用背后的隐忧:

作为靶向技术,尤其是作为验证技术,有什么技术要求或标准?

您看PRM的数据结果时,是否只看Excel表格中样本表达量的数值?

您知道如何判断PRM结果准不准确吗?

也许不少自己做实验的老师,对上述问题也未必有明确认识;另一方面,检测服务市场上的不同服务平台,PRM的做法也千差万别。要明确上述问题其实不难,业界权威已给出解答:蛋白质组专业领域top1期刊《MCP》对于靶向蛋白组方法有明确的guidelinehttps://www.mcponline.org/content/guidelines-publication-manuscripts-describing-development-and-application-targeted-mass),可以看做是领域标准或共识

guideline较长,我们截取比较关键的部分做两点讨论。

1. 靶向检测方法,需要具备的特征和要求

图中标记处,指出:区别于发现阶段的非靶向组学,靶向分析技术需要具备两个最基本的特征:“measure repeatedly”和“internal standards”:

1. measure repeatedly”:如果一个靶向检测方法,缺乏稳定性、重现性,有何资格作为验证技术?所以,如果某些平台在建立PRM方法时,仅仅认为是确立好离子对条件就行了,只是看下所的监测肽段是否能被扫描到,这不能算建立了一个合格的PRM分析方法。对所建PRM方法进行重现性、稳定性的考察是非常必要的。以我们平台为例,在确立好PRM的检测条件和方法后,我们通常会再进行多次上机,对多次检测所得的定量值进行RSD值计算,来考察所建立的方法是否具有良好的重现性,才能保证所建立方法的可靠性,如下图所示:

2. internal standards”:为了减少实验误差,需要在样本中掺入内标,以便校正实验误差,保证结果准确性。如果PRM方法不够准确,自然也不能达到合格验证方法的要求。也就是说,一般需要预先在每个样本中掺入等量的内标品(最好是同位素内标),然后用内标的定量结果来校正所测信号的原始定量丰度,再进行定量分析和比较。此外,内标加入还有一个作用:考察内标的RSD值,评价实际样本检测过程中的稳定性,如下图所示:

2. 检测结果,不能只看定量数值

大家是否想过一个问题,如果PRM的定量结果仅表现为Excel表格中的一串定量数字,我们如何判断这个数字不是随意编写的,甚至经人为随意改的?关于这个问题,《MCP》的guideline也给了明确的指导,而且是非常严肃的要求:

图中标记处,指出:提交定量数据时,一定要同时提交色谱结果。再注意下划线部分(guideline全文只有在这个地方有下划线),如果没有提交的,会直接拒稿!!所谓的色谱图通常就是下面这个:

色谱图是原始结果,是难以伪造的,审稿人看后就明确知道:子离子的保留时间重叠情况、峰型好不好、有没有杂峰,信噪比如何、响应是否理想等等,从而判断离子峰的选择是否合理、定量积分是否准确,最终评价你提供的定量值是否可靠、准确。所以,色谱是非常关键的判断依据,这个必须要有。

总结:

以我们多年的蛋白质组及PRM文章发表的经验,强烈建议:

1. 做完蛋白质组,要及时对结果做验证。等审稿人要求再补实验的,就等于给自己挖坑。对于验证技术,推荐PRM技术,其已被广泛认可和接受,且应用范围广、便利性高;

2. 作为靶向技术PRM之所以被认为是更准确、更可靠,并被用于组学结果的验证,是以其重现性、准确性为基础的。所以PRM方法建立过程中,要注意考查方法的重现性,定量过程中要加内标做校正。对于只做建立,而不做评价和校正的PRM方法,建议谨慎使用,被审稿人质疑的风险很大。

3. 拿到结果,不能只看Excel表中的定量结果,要追溯色谱质谱图。对于不提供色谱图、原始定量结果及计算过程的数据或合作者,请谨慎对待,因为你的结果基本不会被认可。

下期预告

这两期的【知道】,跟大家讨论了蛋白质组分析和研究中大家容易忽视的一些问题。下期开始我们聊聊代谢组。从技术层面上来说,代谢组是最复杂、难度最高的组学技术。因此,大家做分析和项目时,如果有些问题我们不【知道】,掉“坑”系数会非常高。敬请期待下期【知道】:起底最难组学——代谢组。



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