如何做好羊水细胞原位培养?

来源: 上海逍鹏生物科技有限公司   2019-10-21   访问量:914评论(0)

羊水细胞培养和 ,

是染色体病产前诊断的主要手段,
But
羊水中活细胞数少,
且羊水细胞培养技术要求高、
培养时间长、易污染、
所以羊水细胞培养成功率一直很低
培养成功了,
也会遇到分裂相较少,
形态不佳的问题。

不断改进的培养技术
和质量有保证的培养基
对羊水细胞培养至关重要
那 么


 

一、如何做好羊水细胞原位培养?

1. 通常取15-30ml羊水用以完成全部细胞遗传学研究。羊水量不足则可能需要延长培养时间。
2. 无菌操作将羊水均分到两支15ml离心管中。
3. 1000rpm离心10分钟。
4. 小心吸出上清液。
5. 弃去上清液。


离心后吸去上清液

留下的细胞沉淀

6. 用1ml BioAMF-2 重新悬浮细胞块


1ml BI羊水培养基重新悬浮细胞

7. 取35mm培养皿,在盖子上面及下半部侧壁都做好标记(包括编号,姓名等)。为便于移动和观察,将两个小培养皿放入一个90mm培养皿中操作。

8. 滴加0.5ml细胞悬液至每块盖玻片中央,用移液管尖小心摊开(注意避免流出盖玻片外)。


接种细胞

将细胞悬液摊匀在盖玻片上

轻轻放入培养箱

9. 24小时之后,给每块盖玻片补加1.1ml BioAMF-2。
10. 当克隆大小、数量合适并显示有丝分裂迹象时收获细胞(培养7天后)。

二、 如何做好原位收获?
1. 每个培养皿(含1.6ml细胞悬液)加3滴秋水仙胺溶液,37℃孵育30min。


滴加秋水仙素

2. 从培养箱中拿出培养皿至通风橱,自此实验期间避免移动培养皿。

3. 吸弃或倾倒掉培养液(正常情况下不必担心盖玻片掉出),用吸头沿培养皿内壁缓慢加入2ml 0.48M KCl(39℃预热)至盖玻片上(避免吸头直接接触到玻片,2ml在培养皿内壁相对两个地方分两次加入)。



倾倒培养基等

 

沿培养皿内壁加入KCl等

4. 培养皿加盖,室温(25℃左右)下孵育30min。

5. 沿培养皿内壁缓慢加入加1ml新鲜、预冷的固定液(75%甲醇:25%乙酸)至培养皿中,加盖,室温下放置10min。(每天早上配制,4℃冰箱预冷,使用过程中随时放回冰箱)

6. 吸掉或倾倒液体,缓慢加入2ml新鲜、预冷的固定剂,加盖,室温下放置30min。

7. 吸掉或倾倒固定剂,加入2ml新鲜、预冷的固定剂。加盖,室温(25℃左右)下放置10min。

8. 吸去或倾倒固定剂,放于干燥室或化学通风橱,保持室内湿度50%-60%,可以通过加湿器控制环境湿度。

9. 此时需要标记好载玻片以便染色,载玻片必须和培养皿相对应;

 

标记好载玻片

10. 轻轻挤压培养皿,用针从培养皿中沿边缘轻轻挑取盖玻片,放在干净吸水纸上静置5~10min,干燥后加封片胶DPX贴于载玻片上(细胞面朝上)。注意避免盖玻片刮擦或折断等损坏。


轻轻挤压培养皿,用针挑起盖玻片

将盖玻片放在吸水纸上晾干

 

将盖玻片胶粘在载玻片上

11. 室温下静置2小时,直到DPX完全干燥。
12. 60℃烘箱中烘烤过夜。
13. 按要求进行染色体。

 

三、选择好的培养基

以色列BI生产的BIOAMF(医疗器械备案号:沪浦械备20150067号)
专门针对胎儿染色体核型分析的羊水和绒毛细胞原位培养而研发,
BIOAMF用于封闭和开放环境培养,解冻即可用,完全培养基。

缓冲效果更佳,
适用于封闭和开放培养系统,
增加细胞分裂中期产量,
有丝分裂中期染色形态更佳,条带清晰。





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