是什么毁了你的ATAC-seq样品?

来源: 安诺基因   2019-11-22   访问量:750评论(0)

凭借利用Tn5转座酶直接切割染色质开放区域并构建文库的“绝活”,ATAC-seq成为近年表观研究中的“流量”担当。往期文章中,我们介绍了综合应用ATAC-seq和其他组学工具、系统研究染色质开放性变化与转录因子结合间精妙配合的思路,展示了ATAC-seq在高分文章中大放异彩的一面。

但对于一些刚接触表观研究技术的新人,ATAC-seq的样本准备并不像基因组或转录组测序那么简单。都说“好的开始是成功的一半”,小编这里根据实际项目中出现的问题,给大家指明ATAC-seq样本准备中必须回避的“高危区”~

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不同细胞有差别,样本选取要注意


在高等生物中,不同类型的细胞或组织在转录调控层面具有很大的差异,做过转录组或其他表观遗传研究的小伙伴对此应该深有体会。ATAC-seq关注的染色质开放性也存在类似情况:即使是同一个体的不同组织,也会因组织间的异质性而结果不同;在样本中混有关注对象以外的部分,会极大影响结果准确性。
实际取样时,同一组的重复之间需要使用同类细胞或组织,而且应尽量精准地选取所关注细胞/组织,避免引入其他无关成分,才能保证最终结果满足研究需求。例如:研究特定免疫细胞时用流式细胞术进行分选,集中收集目标类型细胞;选取肿瘤组织时洗净表面残留血渍,并尽量去除周边的无关脂肪和结缔组织。

◆ 切记:只有选择准确的研究对象,才能保证后期结论真实可靠~

 


外源污染影响大,去除残留需彻底


细胞培养或取样过程中,有时会出现样本被外源微生物污染的情况。ATAC建库基于Tn5转座酶切断开放DNA,而微生物基因组暴露程度高,相较真核宿主基因组更易发生转座反应。即使少量微生物污染,在所得文库中也会占据较大比例。因此在准备ATAC-seq样本时务必重点防范微生物污染,以免“千里之堤,溃于蚁穴”。

有些情况下样本珍贵,去除微生物继续实验势在必行,这时也要选择正确的方法,务必彻底去除样本中的微生物DNA。之前实际项目中曾出现过此类情况:第一次送样细胞被支原体污染,来自支原体的测序数据占到一半以上;第二次送样前用试剂杀灭支原体,但没能去除残留的支原体DNA,结果仍存在大量污染数据无法使用,耽误了项目进度。
◆ 惨痛的教训提醒大家:对于微生物污染,提前预防优于后期杀灭,除害务净!

 

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微生物污染是ATAC-seq的大忌,在样本准备中千万注意!


合理重复很重要,可用数据宜平齐


ENCODE(Encyclopedia of DNA Elements,DNA元件百科全书)是基因组功能元件研究的跨国研究项目,其官方网站提供了不同表观研究技术的分析流程与标准。在ATAC-seq分析标准中(https://www.encodeproject.org/atac-seq/),明确指出每个实验应设置两个以上生物学重复,样本受限情况下也应该至少设置两个技术重复。考虑到ATAC建库所需样本量低、实验流程简单易于重复,实验设计中建议设置至少2-3个生物学重复,也是后期冲击高分文章所必需的。
另外,即使是重复样本的ATAC-seq,实验中的数据总量、非核污染、重复率、比对率等参数也未必会完全一致。安诺ATAC-seq产品选用可比对序列中非细胞器来源、非重复、正确匹配的测序数据用于分析,尽力确保可用数据量达到ENCODE标准(至少25 M可用片段)。但样本间可用数据量差距太大,也可能导致结果重复性差。建议通过加测或数据截取,将各样本可用数据量调整到相近水平。

 在实验设计早期,收集样本时就要考虑重复设置,等到投稿被editor提醒就晚了!


细胞量莫多勿少,存活率求高舍低


ATAC建库所需细胞量不高,几万个细胞就足够进行一次反应[1];但细胞活性下降会对实验结果造成严重负面影响。考虑到实验操作需要,安诺实验团队建议严格控制每份样本中细胞数量在5-10万的范围内。这样可以减少建库前对细胞样本的操作,降低对细胞活性的不良影响。
尽管实验同事努力压缩中间操作环节、争取早一分钟将活细胞投入建库,但对到样时已“香消玉殒”的细胞,他们也“无力回天”。为了获得更好的实验结果,推荐大家在取样前利用台盼蓝染色或其他方法评估培养细胞活性,选择活性85%以上的细胞准备样本。建库前我们会再次用细胞计数仪检测细胞数量和活率是否合格并记录反馈。细胞活率太低的样本产出会有问题,难免影响到项目进展。
◆ 细胞死亡造成的表观层面变化是不可逆转的,活性高自然结果好~

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两份细胞样本细胞活率对比,质量优劣一目了然~

(图中绿色标记活细胞,红色标记死细胞)


冻存样本只等闲,新鲜细胞约佳期


 

躲开上面几个大坑,终于准备了一份合适的样本,但要怎么处理才适合送样呢?根据以往研究,利用合理方法进行低温冻存的细胞构建ATAC文库,测序结果与新鲜样本一致性很高[2]。安诺基因根据文献资料和实际研发数据制定了合理的样本冻存方法,可以常规接收低温冻存的动物细胞或组织样本用于ATAC文库构建,所得文库与新鲜样本建成文库产出具有极高的一致性。
此外,针对北京区域递送的新鲜细胞样本,我们可以在接收当日启动建库,主要针对部分不适合冻存的细胞类型。新鲜细胞需预留通量在到样后尽快进行实验,建议在细胞准备就绪前7-10天左右提前告知,确保届时能及时处理样本。

◆ 冻存样本建库质量同样有保证,需要送新鲜细胞务必提前预约哦~


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冻存/新鲜细胞ATAC文库产出数据spearman相关性分析结果

 

 

跟着小编看了这么多ATAC-seq送样的注意事项,你是否对样本准备小有心得呢?现在联系安诺基因区域销售经理,就可以获得一份详细的ATAC-seq送样建议。有安诺基因优质的表观基因组研究平台为你护航,现在就开启一场新奇的科研冲浪之旅吧~


 

安诺基因提供包含WGBS、ChIP-seq、ATAC-seq、Hi-C在内的多种表观基因组研究技术,为广大科研工作者提供优质、高效、全面的服务。更多信息还请联系区域销售经理。一起“玩”表观,我们等着你~


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参考文献:

[1] Buenrostro J D, Wu B, Chang H Y, et al. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide[J]. Curr Protoc Mol Biol, 2015, 109: 21 29 1-9.

[2] Milani P, Escalante-Chong R, Shelley B C, et al. Cell freezing protocol suitable for ATAC-Seq on motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells[J]. Sci Rep, 2016, 6: 25474.



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