老师,这是我的满分实验报告!

来源: 武汉金开瑞生物工程有限公司   2019-11-25   访问量:103评论(0)


一、实验原理
凝胶迁移或电泳迁移率实验 (electrophoretic mobility shift assay,EMSA)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析(Hellman LM and Fried MG, 2007)。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,目前也可用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用 (Rio, 2018)。
在实验中,通常将纯化的蛋白或细胞粗提液和生物素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。其中DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢,而探针移动的较快。


图1 EMSA原理图

二、实验目的
对探针和蛋白进行互做验证

三、主要仪器

DYCP-32A核酸电泳仪
GNP-9080型恒温培养箱
GL-21M型高速冷冻离心机
DK-42恒温水浴锅
Forma3111型细胞培养箱
JY92-IIN型细胞超声破碎仪
ZQWY-200型恒温振荡器

四、实验步骤
样本制备
探针标记及检测
形成蛋白-探针复合物
制备凝胶、电泳
转膜
检测

五、课后习题及解答
1.研究蛋白-核酸互作有哪些技术?
答:凝胶电泳迁移率(EMSA)、染色质免疫沉淀(ChIP)、RNA Pull Down / DNA Pull Down、双荧光素酶报告基因、酵母单杂交。
2、为什么实验背景高?
答:1)TBE溶液中有悬浮物;2)曝光或者成像时间过长;3)蛋白的质量不高,杂质多;4)没有清洗干净;5)实验过程中膜没有一直处于湿润状态;6)封闭时间不足或者效率不高。
3、探针的存储条件?
答:为防止探针降解,探针应保存在 -20 ℃。
4、为什么看不到迁移带?
答:1)蛋白降解或者提取量不足;2)标记的DNA探针量太少或者样本中没有可以与探针结合的蛋白;3)探针降解或者探针与蛋白无特异性互作;4)曝光或成像时间过短;5)转膜效率低或者未转过来。
5. Western Blot和EMSA有什么不同的意义
答:Western Blot 只能反应含量,不能反应待测分子的生物学活性。EMSA是蛋白分子与靶序列核酸的结合量,反应的是该分子的生物学活性。
6.在DNA探针的选择上,要考虑哪些重要因素?
答:1)目的DNA的长度应小于300bp;2) 如目的蛋白已被鉴定,应该使用短的寡核苷酸片段;3)长的限制性酶切片段可用于对特定的启动子/增强子区域内的蛋白结合位点定位 。

六、考试重点
1.金开瑞EMSA技术金开瑞EMSA技术
金开瑞提供EMSA检测技术服务,帮助您检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白、特定的蛋白质,并可进行未知蛋白的鉴定。

2技术流程技术流程
接收订单及样品 、实验设计、合成探针、EMSA电泳凝胶配置、EMSA反应、电泳检测、显色反应 、结果交付

3客户提供
1.需提取核蛋白的细胞>107,动物组织不少于400 mg,植物组织不少于2 g,建议客户在金开瑞表达重组蛋白;
2.探针序列;如使用结合蛋白特异性抗体,抗体50 μL以上,浓度大于0.5 mg/mL。


4 最终交付
实验报告,含完整的实验流程、实验结果数据及图片。

七、课外延伸

八、参考文献
Hellman LM and Fried MG, 2007. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols, 2(8):1849-61.
Rio DC, 2018. Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes.Cold Spring Harb Protoc, (4):435-40.



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