关于新冠病毒RT-PCR核酸检测假阴性结果的思考

来源: 上海翊圣生物科技有限公司   2020-2-19   访问量:1075评论(0)

关于新冠病毒RT-PCR核酸检测假阴性结果的思考

在新冠肺炎防治工作开展过程中,随着对发病机制、临床表现、临床体征、诊断技术等方面认识逐步清晰,病人的诊治方案也逐步完善。近期,非常多的讨论集中在新冠病毒核酸检测方法出现漏检和假阴性的问题上面。

1. 在全国其他省份新增确诊人数连续下降的背景下,自212日起连续两天的湖北省卫健委官网发布的通报中,分别提到当日新增临床诊断病例4890例,现有临床诊断病例10567”和“新增新冠肺炎病例14840(含临床诊断病例13332)”。《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版)》在湖北省的病例诊断分类中增加了“临床诊断”。根据该方案,湖北省将临床诊断病例数纳入确诊病例数进行公布。临床诊断病例指具有肺炎影像学特征的疑似病例,但确诊病例诊断标准不变。

2. 112日,李文亮医生因发烧、**在武汉中心医院接受隔离治疗。21日,他发布微博“今天核酸检测结果阳性,尘埃落定,终于确诊了”。回顾李文亮英雄病情确诊进展:共查了3次核酸检测,第一次结果未知,第二次阴性,第三次阳性,用了20天。26号,南方周末报道杭州一所医院病例测了6次核酸试剂都为阴性,直到第7次才测出阳性。

3. 重庆市人民医院三院院区检验科对6种国产新型冠状病毒核酸检测试剂检测性能进行了比较与分析得出结论对弱阳性样品的检测能力有差异,部分试剂的准确性、灵敏度及重复性欠佳,亟需进一步优化,提高其性能,以便更好地适应大规模的筛查需求。对诊断试剂性能及其稳定性提出疑问。

4. 25日,危重症医学专家、中国医学科学院院长王辰院士接受央视采访时表示,对于真是这个病的病人,也不过只有30%-50%的阳性率。通过(采集疑似病患)咽拭子的办法,还是有很多假阴性的。核酸没有发现,但是实际上是的。

一、为何选择核酸检测作为确诊感染的金标准呢?

核酸作为生物的遗传物质,由ATCG四种碱基按照不同的顺序排列组成。碱基排列顺序的相似性决定了物种之间的保守性,具有相似性的碱基序列为物种间的保守序列。碱基排列顺序的不同决定了物种之间的特异性,这些特异性的区域有别于其他物种,具有物种的代表性。新型冠状病毒的遗传物质是RNA,由3.3万个左右的碱基组成。实时荧光RT-PCR是通过引物和探针与新冠病毒核酸特异性的RNA区域高度匹配,一旦检测到,即可判断为“阳性”;高通量测序技术是对新冠状病毒核酸序列进行完整测序并全序列比对分析,与已知新型冠状病毒高度相似的,即可判断为“阳性”。因此,从方法学上来看,核酸检测技术是最直接最本质的病原学证据,优于其他临床表现、临床体征及CT检测等经验判读。这就是我们说病毒核酸检测是确诊感染“金标准”。相较于高通量测序技术,RT-PCR诊断耗时短,检测样本多,结果判定简单快速,检测成本低,特别适合本次大面积流行的新冠肺炎疫情。

1. 新型冠状病毒与SARS冠状病毒ORF1b-nsp14相似性与特异性:·代表相同碱基。

二、假阴性概念及造成假阴性的原因

上面新冠病毒核酸检测方法出现漏检和假阴性的报道不再是关注出结果的速度,更侧重于核酸检测结果的准确性。所谓漏检和假阴性指的是一个新冠肺炎患者应该被确诊为阳性,但RT-PCR未检测到新型冠状病毒RNA。漏检和假阴性会带来的社会恐慌及对病情医治的控制不及时的影响可想而知。

由上面图片可以看出,产生假阴性的原因,可能包括:

1. 方法学:因病毒变异,引物和探针不能识别变异后的序列。

2. 样本采集与保存环节:采样部位不含病毒或病毒含量较低,不能真实反映疾病情况。这涉及到对病毒的致病机理及疾病进程的认识。样品保存不当,造成病毒核酸降解。

3. 核酸提取环节:提取核酸质量差,或提取效率低,病毒核酸有损失。

4. 基因扩增环节:试剂检测下限不够,或试剂性能稳定性欠佳;或仪器设备的准确性和稳定性。

5. 人为因素:实验操作不当。

一句话概括,要避免假阴性的产生,需要全行业全流程的专业质控标准和体系建设来保证RT-PCR检测的稳定性。

三、如何应对假阴性

从规避RT-PCR假阴性问题上,我们需要:

A. 制备达到一定数量的病毒RNA

要求采样部位含有病毒并且病毒含量要达到检测的试剂下限。病毒含量在病程早晚期阶段以及机体不同部位有所不同(这与病毒入侵机制有关),刚感染机体时,病毒在机体内复制少,整体含量均低。在应对未知疫情时,对于感染机制、病症等缺乏了解时,取样部位的选择更加受限。目前了解到,新冠病毒检出的取样部位的难易程度为肺泡灌洗液,深*痰,鼻咽部,口咽部,血液,粪便。通过对疑似病人多个部位同时采样或同一部位反复检测来增加采集到病毒RNA的几率。

样本中病毒RNA需经过提取,以实现病毒的有效富集及纯化。提取要求可以短期内充分裂解释放样本中的核酸,并最大限度的回收高纯度病毒核酸。RNA易被环境中(操作环境及操作人)或医疗样本内源性的RNase降解,提取过程中要特别注意。推崇自动化操作,减少人为因素带来的偏差。

B. 与病毒RNA匹配的引物与探针

病毒传染人群的目的在于存活,在流行一段时间后会发生变异,以保证它的传染性。病毒的变异表现是在它核酸序列突变后,即碱基序列发生变化。用于RT-PCR病毒核酸检测的引物与探针是否会适用于变异后的病毒这是个变量。目前,新型冠状病毒的变异能力R03.77人。因此,针对病毒核酸多个区域设计匹配引物和探针很重要,监控病毒一代传染,二代传染人群数量,实时引入高通量测序手段对病毒核酸进行分析也很重要。

另外,据圈内从事Oligo合成的大佬所说,引物与探针的质量对于RT-PCR表现也至关重要。

C. 高效扩增病毒RNA

相较于CT影像学、临床体征等临床表现,在保证前端取样、核酸提取情况下,RT-PCR更灵敏。它实现了病毒分子体外一变二,二变四成指数倍的积累放大,可以帮助疾病的早发现,早治疗。目前新冠qPCR检测试剂盒的最低检出限一般是200-1000 cp/mL。另一个要考虑的是检测试剂盒最低检出限的稳定性。上游酶原料和辅料的生产工艺对于qPCR检测下限和稳定性至关重要。

最后,针对疾病的诊断不应只依靠于分子检测,应结合RT-PCR检测结果、病人的症状等综合诊断疾病。不过,建议在资源允许,即使是散发性的疑似病例也需经病原学技术确诊。

RT-PCR作为分子诊断手段的假阴性问题,我们还应更细致地结合本次疫情深入思考如何更精准地保证样品采集与保存核酸分离纯化及核酸扩增等各环节的稳定性与精准性

翊圣生物作为分子酶领域全面解决方案的供应商,可提供新型冠状病毒RT-PCR检测和NGS检测的方案,具体可查看:翊圣生物丨助力新冠肺炎诊断和疫苗开发



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