上游工艺精选 | 高效平台灌流培养基的开发策略

来源: 默克公司上海办事处   2020-2-26   访问量:619评论(0)

        细胞灌流培养是蛋白药物连续流生产工艺的重要一环,而高效、低消耗的培养基则是细胞灌流培养工艺成败的关键因素。在fed-batch工艺占主导的今天,市面上缺乏灌流专用的平台培养基。生物制药企业在探索灌流工艺时,往往只能使用fed-batch基础培养基(或混合少量补料培养基)来作为灌流培养基使用,这些培养基没有经过专门的灌流营养优化,往往细胞密度和产量不会太高,而且灌流体积比较大,增加生产成本。

 

本文通过对EX-CELL® Advanced™ HD Perfusion Medium的产品开发过程进行案例分析,为生物制药企业的平台化灌流培养基开发工作提供思路借鉴。

 

 

最早的灌流培养基原型是利用默克CHO细胞基础培养库(basal media diversity panel)来生成。我们将库中不同培养基原型,进行DOE混料设计,生成多个新的混料配方(Mix)平行培养进行对比,并采集相关培养数据,以便进一步优化时进行MVA分析。根据试验结果,从中初步确定出两种最适灌流的混料培养基原型Mix G1 和 Mix P1;将此二种原型经过与多种富营养灌流培养基(basal medium enriched with Feed)反复进行反应器工艺平行对比,最终决定将混料培养基Mix P1作为灌流原型来进一步进行营养优化。

图1 整体优化流程图

 

通过对上一轮实验数据的MVA分析,我们从中找出对灌流工艺关键参数有显著影响的营养成分共计11种。然后,采用DoE中心组合设计(CCD)的方法,对这11种成分的最佳浓度分别进行确定。(见下图2 )

图2 关键组分浓度优化

等高线图显示出11种关键组分中的两种(组分4,9)对蛋白产量的影响

 

最终,我们得到11种组分优化到最佳浓度的全新灌流培养基原型。

 

由于氨基酸在灌流细胞生长中的特殊重要性,我们又对这种新原型培养基单独进行了氨基酸优化:采用上清分析手段,对灌流中,细胞在生长和表达阶段的各氨基酸消耗速率分别进行测量,根据测量结果,我们按照20 pL/cell/day 的CSPR的模型来计算,对培养基中的氨基酸组分进一步强化调整(主要是增加了重要氨基酸的浓度)。氨基酸调整之后, 培养基的CSPR在几个测试的细胞株上均有显著降低,同时细胞单产(qp)也得以进一步提高。(见下图3)。

图3 氨基酸浓度调整后的效果

在测试CHO-S细胞株上,CSPR从60 pL/cell/day降低到37 pL/cell/day,同时qp从原来的最高8.4pcd提高到最高11.7pcd

 

接着对调整后原型的氨基酸消耗速率进行重新测试发现:随着CSPR的降低,细胞的氨基酸消耗速率也较之前发生了变化,降低CSPR,某些氨基酸却出现了过量现象(见下图4)。

图4 在提高氨基酸浓度,降低CSPR之后,

单细胞消耗氨基酸的速率也发生了改变(降低)

 

这表明,培养基中氨基酸浓度及灌流速率等条件的改变,让细胞内的某些代谢通路发生了变化。所以,我们对部分过量的氨基酸进行了重新再平衡调整。

 

我们用不同细胞株对调整后的配方进行反应器灌流验证,以测试其广谱性。结果显示,该配方对不同类型细胞株灌流培养均具有优良效果。(见下图5)

图5 在40 pL/cell/day的CSPR下灌流超过30天,

细胞数维持在50*106 vc/mL,同时单位产量也维持稳定

 

小结

 

在灌流培养基的开发过程中,统计学工具是必不可少的。如通过MVA分析定向找出关键组分,再通过DOE设计,对关键组分浓度进行快速优化,从而提升性能,这是灌流培养基开发的一个重要手段。另外,本案例显示,氨基酸浓度对灌流效果有相对重要的作用,通过氨基酸浓度的优化,较明显提升了培养效果。但在初次调整氨基酸浓度后,细胞的氨基酸代谢也随着出现了一定的变化(如重新测试后发现某些氨基酸有过量现象),说明细胞的氨基酸代谢之间有复杂的关联,对氨基酸的调整需要进行反复摸索,才可找到最佳的浓度组合。

 

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