翊圣出品▏新冠肺炎RT-PCR检测试剂开发策略

来源: 上海翊圣生物科技有限公司   2020-2-26   访问量:1093评论(0)

翊圣出品▏新冠肺炎RT-PCR检测试剂开发策略

从武汉肺炎爆发以来,翊圣生物积极参与其中,基于长期储备的分子酶双向改造、蛋白发酵纯化和高效抗体筛选技术平台,翊圣生物已储备有2000多万份新型冠状病毒检测试剂盒酶原料,可日组装40万次新型冠状病毒核酸检测试剂盒!现在我们总结武汉肺炎诊断试剂盒(RT-PCR法)中的核心原料的开发策略,供读者参阅。

一、开发目的:

利用中国CDCWHO指导文件中相关基因的引物和探针,依次验证质粒标准品、假病毒标准品,筛选出适合新冠病毒的RNA扩增试剂。

二、开发策略:

1. 模拟测试质粒标准品样本

将检测灵敏度和特异性作为RT-PCR探针法检测试剂的核心指标,筛选出了灵敏度至少达到10 copies (20 μL反应体系),高特异性判别新冠病毒ORF1abN geneE gene的候选配方

1. SARS-CoV-2 ORF1abN gene质粒为模板,模板投入量107-101拷贝数,采用CDC建议引物和探针,进行单管多重扩增检测。在此过程中,根据引物和探针属性,优化扩增程序。

2. SARS-CoV-2 ORF1ab质粒,E gene PCR产物为模板,模板投入量107-101拷贝数,采用WHO建议引物和探针,进行单管多重扩增检测。在此过程中,根据引物和探针属性,优化扩增程序。

2. 模拟测试假病毒标准品样本

模拟新冠病毒样本核酸提取到扩增全流程,筛选出了假病毒样本灵敏度至少达到103 copies/mL (25 μL反应体系)的配方

3. SARS-CoV-2 ORF1abN gene假病毒为模板模板投入量107-103 copies/mL,采用中国CDC建议引物和探针,进行单管多重扩增检测。

3. 试剂稳定性测试

将试剂保存条件的容忍度和批次稳定性作为试剂稳定性的评估指标,测定该配方批次间和批次内CV5%,可反复冻融次数50次,4℃,25℃保存一周,性能无变化,保证了质量稳定可靠。

4. 生产批次:H1029950。以SARS-CoV-2 ORF1abN gene假病毒为模板模板投入量107-103 copies/mL,进行单管多重扩增检测,比较Ct值和扩增曲线线型。

5. 生产批次:H1029950H1029920H1025890。以SARS-CoV-2 ORF1abN gene假病毒为模板模板投入量107-103 copies/mL,进行单管多重扩增检测,比较Ct值和扩增曲线线型。

6. SARS-CoV-2 ORF1abN gene假病毒为模板模板投入量106-103 copies/mL,进行单管多重扩增检测,比较4℃、25℃保存1-7天后Ct值和扩增曲线线型。

7. SARS-CoV-2 ORF1abN gene假病毒为模板模板投入量106-103 copies/mL,进行单管多重扩增检测,比较反复冻融50次处理后Ct值和扩增曲线线型。

三、RT-PCR检测试剂盒:Hifair® V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit

至此,即开发出基于多重荧光RT-PCR原理,可以以冠状病毒RNA为模板进行多重定量PCR反应的定量试剂,并作为新型冠状病毒核酸检测试剂盒的核心组分,用于试剂盒组装。

产品信息

产品名称

货号

规格

Hifair® V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit

13110ES60

100 T

Hifair® V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit

13110ES80

1000 T

Hifair® V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit

13110ES92

10000 T

搭配UDGase/dUTP,可预防气溶胶污染产品如下

产品名称

货号

规格

Hifair® V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit (UDG plus)

13111ES60

100 T

Hifair® V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit (UDG plus)

13111ES80

1000 T

Hifair® V nCov Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit (UDG plus)

13111ES92

10000 T

HB200225



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