首页 » 实验方法 » 文库技术 » cDNA文库

cDNA文库组标准流程一:Total RNA的提取

来源:生物谷  2008/10/28   访问量:7451
评论(0)
分享

1.试剂配制

准备工作:

1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、 试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部,置于烤箱内,180℃,烤6小时。

2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后,121℃ 20mins 高压灭菌。

3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。

4、常用试剂及其配方:

▲DEPC水:在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。

▲0.78M柠檬酸纳:PH=4~5

三水合柠檬酸纳    22.94g

加DEPC水定容至100ml,室温放置备用。

                                                                                                           

▲10%肌氨酸钠:

肌氨酸钠           10g

加DEPC水定容至100ml,室温放置备用。              

                    

▲变性裂解液:                 

0.78M柠檬酸钠    8.25ml

10%肌氨酸钠      12.375ml

异硫氰酸胍        118.05g

加DEPC水定容至  250ml,室温放置备用

                  临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%(v/v)

 

▲ 2M 醋酸钠    PH=4.5

            NaAc·3H2O        13.6g

加DEPC水定容至50ml,高压灭菌,室温放置备用

                                                                                                                                                      

3M醋酸钠     PH=5

            NaAc·3H2O        20.4g

            加DEPC水定容至50ml,高压灭菌,室温放置备用

▲    4M LiCL:

                LiCL               24.164g

                    加DEPC水定容至100ml,高压灭菌,室温放置备用

 

▲0.5M EDTA  PH=8.0

                    EDTA              18.61g

用NaOH调PH值至8.0,定容到100ml,高压灭菌,室温放置备用                

    ▲10X  MOPS (3-(N-吗啉代)丙磺酸):

                  MOPS              41.86g

NaAC·3H2O        4.10g

0.5MEDTA(PH 8.0) 20ml

用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L,室温避光放置备用。

▲    1x  MOPS:

10x  MOPS         30ml

加DEPC水270ml,用时现配。

 

▲4x RNA  Loading  buffer:

                  10x MOPS                 400ul

                  甘油(高压过)            200UL

                  溴酚兰                    10ul

                  甲醛(37%)                 72ul

                  去离子甲酰氨             310ul

                  EDTA(0.5M  PH 8.0)        8ul

                  ErBr(10mg/ml in DEPCH2O)   70ul

                  在4℃ 可保持3个月

▲    10x PBS

pH=7.4

NaCl    80g

KCl     2g

Na2HPO4   14.4g

KH2PO4    2.4g

定容至     1000ml

▲变性电泳胶:

称取0.5g琼脂糖,加入47.5ml 1x MOPs,加热至琼脂糖熔化后,冷却至50℃左右,加入2.5ml甲醛,轻轻混匀后倒入电泳托上。

▲变性电泳缓冲液:

在250ml容量瓶内加入5ml甲醛,用1x MOPS定容至250ml

 

2.动物组织total RNA的提取

1.       根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量,将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中,冰浴5分钟。

2.       将组织样品放入变性裂解液中,在高速下匀浆15-30秒/次,直到看不见组织和细胞碎片。

3.       根据表1加入适量2M的乙酸钠(pH4.0),反复颠倒混匀4-5次。

4.       根据表1加入适量酚/氯仿,加盖颠倒混合4-5次,再摇动10秒钟。

5.       冰浴10分钟。

6.       4°C,12000g离心20分钟。

7.       小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,内含所需的RNA。蛋白质和DNA分别留在了有机相和中间层。

8.       加入等体积的异丙醇,-20°C沉淀30分钟以上。

9.       4°C,12000g离心20分钟。

10.   根据表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA。

11.   加等体积的氯仿,加盖颠倒混合4-5次,再摇动10秒钟。

12.   4°C,12000g离心20分钟。

13.   小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,加入等体积的异丙醇,-20°C沉淀至少30分钟。

14.   4°C,12000g离心20分钟。

15.   弃上清,加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀。4°C,12000g离心10分钟。

16.   弃上清,空气中干燥RNA沉淀,直至没有乙醇气味。用适量DEPC水充分溶解RNA沉淀。

17.   取少量RNA用于测定OD值及电泳,其余置-80°C冰箱中保存。

 

表 1

Mg# of tissue

500

800

1000

变性裂解液(ml)

5

8

10

2M NaOAC pH 4 (ml)

0.5

0.8

1

水饱和酚 (mL)

5

8

10

氯仿 (mL)

1

1.6

2

异丙醇(mL)

4

6

8

变性裂解液 (mL)

0.5

0.8

1

异丙醇(mL)

0.5

0.8

1

75% 乙醇(mL)

1

1

1

DEPC-treated H20 (mL)

0.5

0.8

1

 

3.植物组织total RNA的提取

1.      先将研钵于-80℃冰箱中预冷,然后将1g样品在液氮中研磨成粉末状。

2.      将粉末倒入盛有3ml变性裂解液的50ml离心管中,充分匀浆。(1g样品加入3ml变性裂解液)。

3.      加入0.3ml(1/10体积)2M的NaAc(ph4-5)颠倒混匀。

4.      加入3ml(等体积)的水饱和酚,充分振荡,再加入1ml(1/3)的氯仿,振荡。

5.      冰浴10min。4℃,12000g离心10min

6.      小心转移上清于另一离心管中,加入2倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀至少1小时。

7.      4℃,12000g离心20min。

8.      去上清,取沉淀。加1ml 4M的LiCl 溶解沉淀(1mlLiCl/g组织),并转入1.5ml离心管中。

9.      4℃,13000rpm离心15min。

10.  用0.4ml DEPC水溶解沉淀,加1/2体积的水饱和酚,1/2体积的氯仿,颠倒混匀。

11.  4℃,13000rpm离心10min。

12.  取上清,加1/10体积的3MNaAc(ph5)和2倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

13.  4℃,13000rpm离心15min。

14.  弃上清,用1ml 75%的乙醇洗涤沉淀,4℃,13000rpm离心10min。

15.  弃上清,取沉淀,空气中干燥RNA沉淀,直至无乙醇味。

16.  用40-60ul DEPC水溶解(300-500ug/g)RNA沉淀。

17.  取少量RNA用于测定OD值及电泳,其余置-80℃冰箱中保存。

4. TRIzol Reagent 提取total RNA(GIBCO)

1.  查表2根据样品量选择适当的 TRIzol Reagent体积装入50ml RNase-free离心管中,注意样品体积不能超过TRIzol Reagent体积的10%。

2.  将组织样品放入TRIzol Reagent中,高速下匀浆15-30秒/次,直至看不见组织和细胞碎片。

3.室温温育10分钟 。

4.  据表2加入适量体积的氯仿,剧烈震荡15秒钟,然后室温下温育3分钟。

5.  4ºC,12000g离心15分钟,形成淡红色的苯酚/氯仿有机相,中间相和上层水相,水相约占TRIzol体积的60%。

6.  转移上清于另一个Rnase-free的 50ml离心管中。根据表2加入适量异丙醇,-20ºC沉淀1小时以上。

7.  4ºC,12000g离心10分钟。

8.  去上清,据表2加入适量体积的75%的乙醇混匀。

9.  4ºC,7500g离心5分钟。

10.            去上清,空气中干燥或真空抽干RNA沉淀,但不要太干。加入适量体积的DEPC-WATER,溶解沉淀。

11.            取少量RNA用于测定其OD值和电泳,其余置-80ºC冰箱中保存。

表2

组织量

TRIzol Reagent

氯仿

异丙醇

75%乙醇

50~100mg

1ml

0.2ml

1ml

1ml

相关cDNA文库