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cDNA文库组标准流程七:快速鉴定、菌落PCR

来源:生物谷  2008/10/28   访问量:6143
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1.质粒快速鉴定  

试剂:

Protoplasting buffer:

30mM Tris-HCl, pH8.0                   0.33ml/1.0M

      5mM EDTA                               0.1ml/0.5M

      50mM NaCl                              0.1ml/5.0M

      20% Sucrose                            5ml/40%

      50µg/ml RNAseI                         50ul/10mg/ml

      50µg/ml lysozyme                       50ul/10mg/ml

补水至10ml,-20℃分装保存。

 Lysis buffer:

89mM Tris-HCl, pH8.0

89mM boric acid               2ml of 5×TBE

2.5mM EDTA

2% SDS                        2ml of  10%

5% sucrose                    1.25ml of 40%

0.04% bromphenol blue         4mg

补水至10ml,-20℃分装保存。

步骤:

1.将转化后的菌液铺平板,37℃过夜培养。

2.配制0 .6--0 .7%的琼脂糖TBE 胶。

3.用连续加样枪在96孔板中每孔加入10 µl Photoplasting Buffer。

4.用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至含有Photoplasting Buffer 的96孔板中,振荡混匀。

5.用连续加样枪将Lysis Buffer上样于凝胶中,每孔4 µl,用排枪将细胞与Protoplasting buffer混合液上样于凝胶中(细胞在Protoplasting buffer中不宜超过30-40 min),并点上Marker。

6.调节电压为20V(小槽)或40V(大槽),电泳15min,使细胞充分裂解,将电压调高到200V,继续电泳1hr,照相。

7.根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。

2.菌落PCR

1.取适量PCR薄壁管,置于冰上,每管先加入17.3ul的灭菌水。

2.用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中,振荡混匀。

3.依次加入:

                 10xbuffer        2.5            

Mgcl2(25mM)        1.8

DNTP(2.5mM)        1         

T3 引物(10pmol)  1             

T7 引物(10pmol)  1        

Taq酶            0.4     

total           25ul    

各试剂均加好后,离心机上甩一下,使之沉底,置于PCR仪上

4.94℃,2min。

5.            94℃      4分钟

94℃      40秒

53.6℃    40秒      35个循环

72℃      4分钟

72℃      10分钟

4℃       24小时

6.待PCR反应进入4℃后,取下PCR薄壁管,取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳,同时上1Kb DNA ladder。半小时后照相,观察胶图,根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率。

7.将快速鉴定和菌落PCR检测合格的文库送检。

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