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真菌的DNA和RNA提取方法

来源:生物谷  2006/12/20 13:19:00   访问量:6784
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搞真菌基因功能研究的不可避免的总要涉及到DNA和RNA提取,由于真菌中有较多的多糖成分影响到所提DNA和RNA的质量和后续的分析。因此一个高质量的、实惠的提取方法是我们的优先选择,在此分享一下我一直在用的提取方法,供大家参考。
真菌DNA的提取(方法一)
1.取真菌菌丝0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉
2.加入4mL提取液,快速振荡混匀
3.加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1),涡旋3~5min(此处是粗提没有加酚,可以节约成本的哟!)
4.1000rpm,4℃,5min
5.上清用体积的氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次(10,000 rpm,4℃离心5 min)
6.取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀, 混匀, 静置约30 min
7.用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干,重悬于500 ulTE中
8.加入1 ul RNaseA (10 mg/mL),37℃处理1 hr
9.用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000 rpm,4℃离心5 min)
10.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上
11.沉淀用75%乙醇漂洗,风干, 溶于200 ulTE中,-20 ℃保存备用
DNA提取液:0.2M Tris-HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,0.01M EDTA,1%SDS,
3M NaAc
TE:10 mmol/L Tris-HCl pH8.0,1 mmol/L EDTA
酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)
氯仿:异戊醇(24:1)
异丙醇
无水乙醇
75%乙醇
RNaseA

真菌DNA的提取(方法二)
1.真菌菌丝0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉
2.加入3 mL 65℃预热的DNA提取缓冲液,快速振荡混匀65℃水浴30 min, 期间混匀2-3次
3.加入1 mL 5M KAc,冰浴20 min
4.等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000 rpm,4℃离心5 min)
5.取上清,加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇, 混匀, 静置约30 min
6.用毛细玻棒挑出絮状沉淀, 用75%乙醇反复漂洗数次, 再用无水乙醇漂洗1次, 吹干,重悬于500 L TE中
7.加入1 ul RNaseA (10 mg/mL),37℃处理1 hr
8.用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000 rpm,4℃离心5 min)
9.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇, -70℃沉淀30 min以上
10.沉淀用75%乙醇漂洗,风干, 溶于200 ul TE中,-20 ℃保存备用。
DNA提取缓冲液:100 mM Tris-HCl(pH8.0),20 mM EDTA(pH8.0),1.5 M NaCl, 2% CTAB(W/V),4% PVP40(W/V)和2% 巯基乙醇(V/V),PVP和巯基乙醇使用前加入
5M KAc

方法一和二,是大同小异。主要是DNA提取液配方不一样!成本也不一样的哟!
奇怪的是鸭鸭上怎么没办法输入微升的符号!只有用ul代替了!
真菌菌丝的总RNA的提取
RNA提取缓冲液(CTAB):2% CTAB(W/V),2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP(W/V),100 mM Tris-HCl(pH8.0,DEPC处理的水配置),25mM EDTA, 0.5g/L 亚精胺Spermidine,2.0M NaCl,2%巯基乙醇(V/V,使用前加入)。由于在高温灭菌条件下,Tris-HCl要和DEPC发生反应,所以配RNA提取缓冲液时直接用DEPC 处理的水配制即可。
SSTE:1 M NaCl,0.5% SDS(W/V),10 mM Tris-HCl pH8.0,1.0 mM EDTA
10M LiCl 直接用蒸馏水配10M LiCl,加1‰的DEPC过夜后,高温灭菌。
3M NaAc
氯仿:异戊醇(24:1)
酚(pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)
DEPC处理水 用1‰的DEPC处理蒸馏水过夜,高温灭菌
无水乙醇
70%酒精
1. 实验开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中加入ME(巯基乙醇)(10mL加80ul,50mL中加入300ul)。
2.取约0.8g菌丝体(液体培养获得的菌丝用真空抽滤即可!固体培养就更好说了),在液氮中迅速磨成精细粉末,装入50 mL离心管,按1g材料8mL的量加入预热的RNA提取液,颠倒混匀。
3. 65℃水浴3-10 min,期间混匀2-3次
4. 加入等体积的酚(注意是酸酚pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提(10,000 rpm,4℃,5 min)
5. 取上清,等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提(10,000 rpm,4℃,5 min)
6. 加入1/4V体积10M LiCl溶液,4℃放置6hr以上(或过夜)
7. 10,000 rpm,4℃离心20 min
8. 弃上清,用500 ulSSTE溶解沉淀
9. 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提两次, 氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000 rpm,4℃,5 min)
10. 加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30 min以上
11. 12,000 rpm,4℃离心20 min
12. 弃上清。沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
13. 加200 ul的DEPC处理水溶解
14. 用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量
(在抽提过程中,若蛋白质含量或其它的杂质还较多,可以增加抽提次数)
注意:提取RNA请尽量在低温下操作,如果条件不容许,在室温下操作的时间要尽可能的短。

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