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基因定点突变step by step

来源:生物谷论坛  2007/3/12 20:16:00   访问量:14629
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本贴先讲最简单的一个点的定点突变技术,其它较长片段的突变,删除,插入技术以后会慢慢奉上:

在做实验之前,我们首先要搞清楚实验的目的和实验的原理。

实验的目的应该比较明确吧:就是要把自己的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做:
第一:我们吊出来的基因有点突变,相信这可能是大家经常会遇到的问题。基因好不容易吊出来,并装进了自己的载体,却发现有一两个碱基跟自己的预期序列或所有的公共数据库不匹配,然后暴昏。
大家实验室里面还是用Taq酶为主吧,Pfu这样的高保真酶大家应该用得不多吧,Taq酶的优点和缺点都很明显:优点就是扩增效能强,缺点就是保真性差,其错配机率是比较高的,相关数字忘了,大家可以去网上查那个数字,不过感觉如果是2000bp的基因,如果扩四五十个循环的话,很大机率会出现点突变,当然这也跟具体PCR体系里的Buffer有很大关系,详细情况这里就不讨论了。
第二:要研究基因的功能,在基因上自己选定位置更换碱基的保守序列,或者改造成不同的亚型,总之就是要人工改造碱基序列符合自己的实验需要,相信这也是那些研究基因的人经常的一种思路吧。

对于第一种情况:我们首先要分析出现碱基不匹配的位置是不是重要的位置,如果不是很重要,大可不必管它,比如说是三联密码子的最后一位,碱基的改变并没有引起相应氨基酸的改变,那么一般情况下也可以不去理它。另外,在NCBI上人类的基因的版本一直在变化,也就是说同一个基因有不同的版本,或者称不同的亚型,其碱基序列有些许的差异,只要自己克隆出来的碱基序列与其中一个相匹配,一般也就可以不做定点突变了。如果有时间没钱,那干脆重新PCR然后再克隆进自己的载体了,不过最好换个保真性好一点的酶如PFU,或者PCR循环数低一点,不过这些东西有时候也得靠运气啦。实在不行的话再来做定点突变。
对于第二种情况:这种情况下一般也就只能做定点突变了。

接下来开始聊一聊定点突变的原理吧,那个Stratagene试剂盒!上面有一个说明书,说得好像很正规,不过上面好多都是什么专利啊什么注意之类的话,看都不看,我们简明扼要地只讲实验方面,通过设计引物,并利用PCR将模板扩增出来,然后去掉模板,剩下来的就是我们的PCR产物,在PCR产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆,再测序确定就行了。
大家马上就会想到几个问题了:
第一:引物怎么设计呢?
第二:模板怎么去掉呢?
第三:怎么拿到质粒呢?

对于第一个问题:怎么设计引物?
我只能讲一些原则,并举一些例子。
引物设计的原则其它贴子上都有讲,这里就不重复了:
不过这种突变引物要加上一个原则:
一般都是以要突变的碱基为中心,加上两边的一段序列,两边长度至少为11-12base pair。
若两边引物太短了,很可能会造成突变实验失败,大家应该都知道,引物至少要11-12个base pair才能与模板搭上,而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上,所以两边最好各设至少12个base pair,并且合成多一条反向互补的引物。
这么说大家可能不是很清楚,那我就举个例子吧:

X71661.1 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 960
现有序列 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 924
*********************************************** ************
|------>deletion

X71661.1 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 1020
现有序列 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT 984
************************************************************
(上面为目的序列,下面为现有序列:我们发现有一个A碱基的缺失,其直接结果是在表达蛋白时后面的氨基酸全部错配)

我们以它为中心设计引物:两边各至少12个碱基,左边由于含有较多的A造成引物GC%含量过低,故拉长引物使GC%含量不至过低,也使引物退火温度升高。

故合成引物CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG
并合成反向互补引物CTTCTGGAATTCCTCTTTTTTTTTATCCAATTCTTGTTG
其实也不一定要反向互补序列,只要反向引物也是两边都有大于12个碱基,同时符合引物设计的原则就行了。
引物合成公司有很多家,大家可以去寻找,不同厂家的引物在价钱质量上有一些差别,不过价钱一般都是一块多一个碱基,合成时间约为一周。
这样的结果是PCR时把整个质粒都给扩出来了,得到的PCR产物是一条链完整,另一链有缺刻的PCR产物

对于第二个问题:
怎么去掉PCR产物呢?再简单的方法就是用DpnI酶,DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切,我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒,从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来(除非你用的是甲基化缺陷型的菌株),而PCR产物都是没有甲基化的,所以DpnI酶能够特异性地切割模板(质粒)而不会影响PCR产物,从而去掉模板留下PCR产物,所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株,不会那么凑巧吧,哈哈。

关于第三个问题:
直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了,呵呵,然后再筛选出阳性克隆,并提出质粒,拿去测序(这个就不用我多说了吧),验证突变结果,一般都没问题的啦,我做了几十个突变了,到目前为止还没有做不出来的,呵呵,不要砸我啊。

下面讲一下具体的实验步骤以及一些实验中要注意的事情:
1、  根据现有基因设计引物;
2、  合成引物并准备好模板;
3、  PCR,
4、  DpnI处理酶切产物;
5、  转化酶切产物;
6、  筛选 阳性克隆;
7、  送测序并测全长。
最后就是庆祝啦,呵呵,没什么复杂的。

引物和质粒都准备好后,当然就是做PCR喽,不过对于PCR的酶和buffer,不能用平时的,我们做PCR把整个质粒扩出来,延伸长度达到几个K,所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer,另外,要用保真性能较好的PFU酶来扩增,防止引进新的突变。
那种Quick change试剂盒分为几种不同的类型
什么QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒 、QuikChange® XL Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒(>8kb)从原理上是一样的,只是PCR的酶和BUFFER不一样,后面用了比较适合长片段扩增的酶和BUFFER罢了,没什么特别的东西。

另外,DpnI处理的时间最好长一点,最少一个小时吧,最好能有两三个小时,因为如果模板处理得不干净,哪怕只有那么一点点,模板直接在平板上长出来,就会导致实验失败。

大家有什么问题我们可以继续讨论。

另外,如果大家既没有DpnI酶也没有好的PCR酶和BUFFER的话,那也有其它办法进行定点突变,只是麻烦一点,如果大家有需要的话,我会把方法贴上来。
对于多点突变技术及较长片段的缺失插入技术,同样的,如果大家有需要的话,我会把方法贴上来。
不过,如果你有钱的话,那就去买那个试剂盒吧,其中QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit标准点突变试剂盒 、QuikChange® XL Site-Directed Mutagenesis Kit长模板单点突变试剂盒(>8kb)的原理我上面已经说了,只是补充了一些我认为的注意事项。如果你更有钱的话,那么你可以叫其它公司帮你做定点突变服务,大约是改一个点1000元左右。

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