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线粒体的提取与观察

来源:生物谷  2007/4/10 22:29:00   访问量:4522
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线粒体是细胞中重要的细胞器,存在于绝大多数生活细胞中,它的主要功能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。正由于这样,对线粒体膜,呼吸链酶及线粒体DNA等成分的结构,功能以及物理化学性质的研究已经成为细胞生物学研究中的重要课题,所以提取线粒体的技术已经成为线粒体研究中必不可少的手段,线粒体大量存在于代谢旺盛的细胞中,如动物的心肌,肝,肾等器官和组织的细胞中,大量置备线粒体就是从这些器官组织中提取,当所用样品较少时(如电镜和光镜的观察)可采用从组织培养细胞中提取,本实验就是介绍两种材料制备用于光镜观察的线粒体。  

一、目的与要求
了解提取线粒体的基本原理及其过程,通过光学显微镜的观察了解体外分离的线粒体的一般形态  

二、 基本原理
线粒体具有完整的结构,一定的大小和质量,低温条件下在等渗液中破碎细胞,差速离心后,获得线粒体。经活性染料Janus green B染色,线粒体呈浅蓝色。  

三、实验内容
1.线粒体的分离提取      2. 鼠肝的匀浆制备      3. 线粒体的活体染色  

四、实验步骤
(一)动物组织线粒体的分离,提取与观察

显微镜检查:将1%Janus green B溶液按1:1比例加入线粒体悬液中,在室温或水浴中染15~20分钟,用吸管吸取一滴线粒体悬液,滴于载玻片上,加盖玻片后,放显微镜下进行观察,线粒体为蓝绿色圆形颗粒。
2.组织培养细胞的线粒体的提取与观察

(三)操作中应该注意的问题
1.  整个操作过程为保证线粒体的完整,应尽量使操作时的环境如温度(0—4℃),pH (7.0左右)保持恒定,同时尽可能短操作时间。
2.  组培细胞消化时要特别小心,防止损失或反复。(损失指细胞脱落到消化液中)。
3.  匀浆时,所用的介质一定是等渗缓冲液,常用的有0.25 mol/L蔗糖溶液或生理盐水代替Hank’s液
4.  匀浆次数依照匀浆器的松紧而定,次数过少,细胞破损不完全,就会影响线粒体产量。
5.  所以取2/3上清夜用来制备线粒体是为防止细胞碎片过多影响观察。
6.  整个分离过程,一般最好在30—60分钟内完成,不宜过长。
  
五、习题
1.  叙述动物细胞线粒体的提取过程及其注意事项。
如何鉴定上述方法提取的最终产物是线粒体?

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