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Southern blot实验方法与步骤

来源:生物谷  2007-5-15 22:18:00   访问量:12367
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用于检测重组DNA,也可分析DNA样品中是否有与探针序列同源的DNA片段。用于基因诊断,也可验证检测片段的分子量大小。将基因组DNA经限制性内切酶酶切,进行琼脂糖电泳,把分离后定位在凝胶上的不同分子量的DNA经碱变性处理,将凝胶中变性的DNA转移至一固相支持滤膜。利用标记的某一DNA、RNA或寡核苷酸与固着于滤膜上的DNA发生同源性杂交,利用放射自显影(化学发光法或显色法)检测。
(一) 器材:台式离心机,恒温水浴锅,电泳仪,水平电泳槽,杂交炉,杂交袋,尼龙膜或硝酸纤维素膜,转印迹装置,滤纸,吸水纸,紫外交联仪或80℃烤箱,摇床,X线胶片。
(二) 试剂:限制性内切酶,DNA加样缓冲液,DNA Ladder Marker,0.25M HCl,变性液(0.5M NaOH,1.5M NaCl),中和液(0.5M Tris- HCl PH7.5,3M NaCl), 转印迹液20╳SSC(3M NaCl,0.3M柠檬酸钠,PH7.0),标记探针, 2╳SSC,预杂交液和杂交液,2×洗液(2×SSC,0.1%SDS),0.5×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS),1×缓冲洗液(0.1M马来酸,0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20),1×封阻液[1%(W/V)封阻剂溶于1×马来酸溶液(0.1M马来酸,0.15M NaCl ,PH7.5)],1×检测液(0.1M Tris- HCl,0.1M NaCl,PH7.5),抗-地高辛-碱性磷酸酶。

注意:若基因组DNA过低,要以较大体积进行限制酶消化,消化完毕后,可以通过乙醇沉淀、浓缩DNA片段,加少量DNA加样缓冲液点样。
2、 消化好的样品点样于0.7%琼脂糖凝胶进行电泳;
注意:为保证DNA均匀分散于加样孔,应缓慢将样品加至加样孔。
3、 电泳结束后,将凝胶依次用如下试剂处理进行碱变性,室温下轻轻摇动确保溶液覆盖凝胶 0.25M HCl 10-15 min
蒸馏水摇洗 5 min
变性液 40 min
蒸馏水摇洗 5 min
中和液 15 min,2次;
4、 在凝胶碱变性的同时,制备转印迹装置。Southern blot转膜技术有三种:1),毛细管转移法;2),电转移法;3),真空转移法。这里介绍最经典的毛细管转移法(向上转移),在转印迹槽中,倒入20╳SSC溶液,槽中置一固相支持物,在固相支持物上从下向上依次置入:两张与凝胶等宽的滤纸,将滤纸纵向自固相支持物垂于转印迹槽中(简称“桥”),底面在上的凝胶,滤膜(与凝胶等大),滤纸(与凝胶等大),吸水纸(略小于滤纸,5-8cm高),400-800g重物。凝胶四周用Parafilm膜包围防止短路。滤膜事先用2╳SSC浸湿至少5 min。滤纸事先用20╳SSC浸湿。转膜4-18小时;
注意:转膜装置中各层滤纸和膜之间要将气泡赶净。一旦建立转膜系统后,要防止滤膜和凝胶错位。防止吸水纸倒塌和完全湿透,要及时更换吸水纸。
5、 转膜结束后,取出滤膜,边角剪一小角做标记。滤膜于2╳SSC摇洗5min,用滤纸吸干;6、 用紫外交联照射(正面朝上)或于80℃烤箱烘烤0.5-2小时;
7、 膜可立即进行预杂交和杂交,或保存于4℃待以后应用;
8、 预杂交和杂交
1) 将杂交膜浸湿于6╳SSC 2min,同时预热预杂交液和杂交炉至预杂交温度;
2) 杂交膜封于杂交袋,按0.2ml/cm2膜面积加入预杂交液,预杂交至少1小时;
3) 用于southern blot的探针可分为DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针。对探针的标记方法又可以分为放射性标记和非放射性标记。这里主要介绍非放射性地高辛标记探针的杂交方法。杂交时各种探针的用量:DNA探针,5-25ng/ml;RNA探针,100ng/ml;寡核苷酸探针,0.1-10pmol/ml。双链DNA探针提前100℃变性10min后迅速冰浴,单链探针无需变性。将处理后的探针加入杂交液温浴至杂交温度。杂交温度的选择根据杂交液的不同而不同;
注意:应用寡核苷酸探针时,杂交温度的选择。Tm=4╳(G C) 2╳(A T),杂交温度比Tm低约10℃。
4) 弃去预杂交液,将含探针的杂交液注入杂交袋,至少3.5ml/10╳1℃m,置入杂交炉滚动;
9、 杂交后的洗膜处理过程,顺序如下:
2×洗液 2×15min
0.5×洗液 2×15min
1×缓冲洗液 1×3min
1×封阻液 1×60min
抗体液* 1×30min
1×缓冲洗液 2×15min
1×检测液 1×5min
* 抗-地高辛-碱性磷酸酶用1×封阻液稀释10,000倍(若用显色法稀释5000倍;若用CDP-Star检测用20,000倍稀释);
10、将膜浸于CSPD液(CSPD用1×检测液稀释100倍,CDP-Star也用1× 检测液稀释100倍)室温避光静置 5min;回收剩余的CSPD液或CDP-Star液避光保存于4℃可反复应用3-5次;
11、将膜上残液吸净,用保鲜膜封好于37℃反应15min,然后将膜固定于压片夹,进行曝光。
注意:若用显色剂检测,新鲜配置显色剂(45μlNBT和35μl BCIP溶于10ml 1×检测液),将膜浸于显色剂中避光反应4-16小时,反应期间不要移动膜。

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