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霉菌水浸标本片的制备与观察

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(一)实验目的:学习自制水浸片观察霉菌的形态

(二)实验原理:霉菌的营养体是分枝的丝状体。其个体比细菌和放线菌大得多,分为基内菌丝和气生菌丝。气生菌丝中又可分化出繁殖丝。不同霉菌的繁殖菌丝可以形成不同的孢子。

霉菌菌丝较粗大,细胞易收缩变形,且孢子容易飞散,所以制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成的霉菌标本片的特点是:细胞不变形,具有杀菌防腐作用,且不易干燥,能保持较长时间,溶液本身呈蓝色,有一定染色效果。

利用培养在玻璃纸上的霉菌作为观察材料,可以得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态;也可以直接挑取生长在平板中的霉菌菌体制水浸片观察。

(三)实验器材

1. 活材料:在马铃薯琼脂平板上或用玻璃纸透析培养法培养3-4天的根霉(Rhizpus sp.)、青霉(Penicillum sp.)、曲霉(Aspergillus sp.);

2. 染色液和试剂:乳酸石炭酸棉蓝染色液、50%酒精(V/V)。

3. 器材:剪刀、镊子、载玻片、盖玻片、解剖针、显微镜。

(四)实验方法

1. 制水浸制片观察法

在载玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液或蒸馏水,用解剖针从生长有霉菌的平板中挑取少量带有孢子的霉菌菌丝,用50%的乙醇浸润,再用蒸馏水将浸过的菌丝洗一下,然后放入载玻片上的液滴中,仔细地用解剖针将菌丝分散开来。盖上盖玻片(勿使产生气泡,且不要再移动盖玻片),先用低倍镜,必要时转换高倍镜镜检并记录观察结果。

2. 玻璃纸透析培养观察法

(1)玻璃纸的选择与处理 要选择能够允许营养物质透过的玻璃纸。也可收集商品包装用的玻璃纸,加水煮沸,然后用冷水冲洗。经此处理后的玻璃纸若变硬,必定是不可用的,只有那些软的可用。将那些可用的玻璃纸剪成适当大小,用水浸湿后,夹于旧报纸中,然后一起放入平皿内121℃灭菌30min备用。

(2)菌种的培养 按无菌操作法,倒平板,冷凝后用灭菌的镊子夹取无菌玻璃纸贴附于平板上,再用接种环沾取少许霉菌孢子,在玻璃纸上方轻轻抖落于纸上。然后将平板置 28-30℃下培养3-5天,曲霉菌和青霉菌即可在玻璃纸上长出单个菌落(根霉菌的气生性强,形成的菌落铺满整个平板)。

(3)制片与观察 剪取玻璃纸透析法培养3-4天后长有菌丝和孢子的玻璃纸一小块,先放在50%乙醇中浸一下,洗掉脱落下来的孢子,并赶走菌体上的气泡,然后正面向上贴附于干净载玻片上,滴加1-2滴乳酸石炭酸棉蓝液,小心地盖上盖玻片(注意不要产生气泡),且不要移动盖玻片,以免搞乱菌丝。

标本片制好后,先用低倍镜观察,必要时再换高倍镜。注意观察菌丝有无隔膜,有无假根、足细胞等特殊形态的菌丝。注意其无性繁殖器官的形状和构造,孢子着生的方式和孢子的形态、大小等。

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