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凝胶层析法脱盐和分离蛋白质

来源:生物谷     访问量:6019
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(一)原理

凡盐析所获得的粗制蛋白质(盐析得到的IgG)中均含有硫酸铵等盐类,这类将影响以后的纯化,所以纯化前均应除去,此过程称为“脱盐”(desalthing)。脱盐常用透析法和凝胶过滤法,这两种方法各有利弊。前者的优点是透析后析品终体积较小,但所需时间较长,且盐不易除尽;凝胶过滤法则能将盐除尽,所需时间也短,但其凝胶过滤后样品体积较大。所以,要根据具体情况选择使用。前实验中样品体积较小,凝胶达滤后样品体积不会太增加,所以选用凝胶过滤法。

(二)试剂与器材

(1)Sephadex G-25。

(2)0.0175mol/L,pH6.7磷酸盐缓冲液。

(3)奈氏(Nessler)试剂:于500ml锥形瓶内加入碘化钾150g,碘110g,汞150g及蒸馏水100ml。用力振荡7~15min,至碘的棕色开始转变时,混合液温度升高,将此瓶浸于冷水内继续振荡,直到棕色的碘转变为带绿色的碘化钾汞液为止。将上清液倾入2000ml量筒内,加蒸馏水至2000ml,混匀备用。

(4)20%(W/V)磺基水杨酸溶液。

(5)1.5cm×20cm层析柱。

(6)黑、白比色磁盘。

(三)操作

(1)取层析柱1支(1.5cm×20cm),垂直固定在支架上,关闭下端出口。将已经溶胀好的Sephadex G-25中的水倾倒出去,加入2倍体积的0.0175mol/L,pH6.7磷酸盐缓冲液,并搅拌成悬浮液,然后灌注入柱,打开柱的下端出口,继续加入搅匀的Sephadex G-25,使凝胶自然沉降高度到17cm左右,关闭出口。待凝胶柱形成后,在洗脱瓶中加入0.0175mol/L,pH6.7磷酸盐缓冲液以3倍柱体积的磷酸盐缓冲流过凝胶柱,以平衡凝胶。

(2)凝胶平衡后,用皮头滴管除去凝胶柱面的溶液,将盐析所得全部IgG样品加到凝胶柱表面,打开柱下口,控制流速让IgG样品溶液慢慢浸入凝胶内。凝胶柱面上加一层的0.0175mol/L,pH6.7磷酸盐缓冲液,并用此缓冲液洗脱,控制流速为0.5ml/min左右。用试管收集洗脱液,每管10滴。

(3)在开始收集洗脱液的同时检查蛋白质是否已开始流出。为此,由每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盘中,加入1滴20%磺基水杨酸,若呈现白色絮状沉淀即证明已有蛋白质出现,直到检查不出白色沉淀时,停止收集洗脱液。

(4)由经检查含有蛋白质的每管中,取1滴溶液,放置在白色比色盘孔中,加入1滴奈氏试剂,若呈现棕黄色沉淀说明它含有硫酸铵。合并检查后不含硫酸铵的各管收集液,即为“脱盐”后的IgG。

注意:在检测时,用皮头滴管吸取管中溶液后应及时洗净,再吸取下一管,以免造成相互污染假象。

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