细菌基因组DNA快速提取试剂盒

产品组分

注： 裂解液MS中含有变性剂,请不要直接接触皮肤。

          漂洗液PE初次使用前用无水乙醇按1: 3稀释，即含75%乙醇。

保存条件

蛋白酶K于-20℃保存，其余试剂置于室温（15-25℃）干燥条件下保存1年。

消化缓冲液如DS和MS有沉淀，在55℃加热溶解，待恢复室温后混匀即可使用。不会影响基因组DNA纯化效率。

产品说明

    本产品用于细菌基因组DNA的小量提取。其纯化原理是利用细胞裂解液裂解细胞释放基因组DNA，由硅胶膜柱可逆吸附基因组DNA，经蛋白酶消化、漂洗液清

洗除去蛋白质、脂质等杂质后，用纯化液洗脱获得基因组DNA。本产品可从0.5-2 ml对数生长期的菌液（不超过10⁶–10⁸ 个）中提取到3-20μg 超纯基因组DNA

（OD_260/280 = 1.7-1.9），此基因组DNA可直接用于酶切、PCR等后续实验。

产品特点

• 高效：一次可获得3-20 μg基因组DNA。
• 快速：30min内即可获得超纯的基因组DNA。
• 安全: 整个操作中不用酚/氯仿有机物。
• 高纯度：无须再纯化即可直接用于下游实验。

产品用途

• 常规限制性酶切
• PCR扩增
• 文库构建
• Southern 杂交
• 分子标记分析

质量控制

纯化的基因组DNA质量通过限制性酶切和单拷基因的PCR扩增鉴定。

细菌基因组DNA提取流程图

图1  细菌基因组DNA纯化流程图

操作方法

 1  取0.5-2 ml处于对数生长期菌液，置于1.5 ml离心管中。12,000 rpm离心1min，弃上清。

 2  向收集到的菌体沉淀中加入200 μl 缓冲液DS，用漩涡振荡器剧烈振荡直至菌体彻底悬浮。

    注：对于较难破壁的革兰氏阳性菌，需加入溶菌酶消化细胞壁后，再进行基因组DNA的提取。具体方法为：向步骤1收集到的菌体中，加入180 μl 缓冲液（20 mM Tris, pH8.0，

2 mM EDTA，1.2% Triton100）和终浓度为20 mg/ml的溶菌酶（东盛货号：N9021），振荡混匀。37℃处理30min以上。

           如需要去除RNA，加完消化缓冲液DS或溶菌酶后，加入4 μl RNase A（100 mg/ml）溶液，震荡混匀，室温放置5min。

 3  加入20 μl蛋白酶K溶液，混匀。

 4  加入220 μl裂解液MS，漩涡振荡混匀，直至形成均一的悬浮液。65℃温浴10min。溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

   注：加入裂解液MS时可能会产生白色沉淀，一般65℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细菌细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的

DNA 不纯。    

           如菌体超过1.5 ml，可适当延长温浴时间。

5   加入220 μl无水乙醇，上下颠倒混匀。此时可能出现絮状沉淀，将溶液及絮状沉淀转移到纯化柱中。12,000 rpm离心1min，弃滤液。

   注：此时基因组DNA被吸附于DNA纯化柱中的硅胶膜上。

           如柱子堵塞表明菌体过量。若发生此情况，减少菌量，或适当延长离心时间，直至洗脱液顺利离心至离心管为止。

6   加入500 μl去蛋白液PS。12,000 rpm离心1min，弃滤液。

   注：此步骤的作用是将硅胶膜上吸附的蛋白、脂质等杂质洗脱，以获得高质量基因组DNA。

7   加入500μl漂洗液PE。12,000 rpm离心1min，弃滤液。

   注：漂洗液PE初次使用前用无水乙醇按1: 3稀释，即含75%乙醇。

8   加入500μl漂洗液PE。12,000 rpm离心1min，弃滤液。

9   12,000 rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体。

   注：此步骤的作用是去除残留乙醇，避免影响后续的酶促反应（PCR或酶切）。同时利于基因组DNA充分溶解。

10 将纯化柱置于新的1.5 ml离心管中。向纯化柱中央处，悬空加入30-100μl洗脱液TE。室温放置2min。于12,000 rpm离心2min，管底即为高纯度基因组DNA。

-20保存。

注：洗脱液TE可用去离子水代替，但其pH需为8.0-8.5。体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而定。

对洗脱液TE 60℃预热，会提高基因组DNA的产量。

图2  细菌基因组DNA电泳图

注意事项

1  应尽量使用新鲜的菌体，确保提取的基因组DNA不被降解。

2  在操作步骤4中，菌体应充分悬浮，不要残留菌块，避免影响溶菌效果。

3  在操作步骤5种，加入无水乙醇后，可能会出现絮状沉淀，应将离心管内的溶液及絮状沉淀转移到纯化柱中，确保基因组DNA的得率。

4  基因组DNA需长期保存时，建议使用纯化液TE。分装后保存于-20℃或-80℃。

5  基因组DNA 浓度及纯度与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。

基因组DNA的浓度及纯度检测

1  基因组DNA 片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。回收得到的DNA 片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。

2  DNA 应在OD₂₆₀ 处有显著吸收峰， OD₂₆₀ 值为1 相当于大约50μg/ml 双链DNA、40 μg/ml 单链DNA。

3  OD_260/280比值应为1.7–1.9，如果洗脱时不使用纯化液TE，而使用去离子水，比值会偏低，因为pH 值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。