1、用pKOTW1 质粒先做一下转化，把质粒转入感受态细胞内

2、将菌液涂到LB平板上倒置、过夜培养

3、挑取单克隆菌落，打入5毫升左右的液体LB，摇床12-16小时，吸取两毫升左右菌液，做一个小提，测浓度，跑胶，4、确定提出来之后，再用剩余菌液按1:100比例加入液体LB，摇床12-16小时

5、摇床结束后，用去内毒素的中提或者大提，可以留几毫升菌液加入适量甘油制成甘油菌冻-80，提出来的pKOTW1 质粒就可以用于转染了。

如果想直接用甘油菌，那么只需要做第四第五步就行。

以Invitrogen的Lipofectamine 2000为例，需要注意以下几点：

1、DNA的量：Lipofectamine 2000=1：2~3

2、细胞密度大约占培养板的80%左右，转染。

3、转染期间不要加抗生素，否则会导致细胞死亡。

pKOTW1 质粒步骤如下：以24孔培养板为例：

1、转染前一天细胞换新的培养基

2、制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，如下:

a、用50ul无血清培养基稀释DNA（0.8g），轻轻混匀；

b、Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用48ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5分钟；

c、将a+b的液体加在一起，pKOTW1 质粒轻轻混匀，室温孵育20分钟，使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成；

3、将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中，轻轻前后摇匀；

4、放入37度孵箱中培养24~48h后，1：10传代，加入G418筛选。加入G418的量最好设几个梯度或者转染前做MTT，找好G418对你所转细胞致死量的浓度。

5、等细胞在G418作用下，长满后冻存几支（保种）。再克隆化培养：将细胞消化后计数50个细胞，加入22ml完全培养基中，混匀，分装在96孔板中（200ul/孔）。第二天在显微镜下，pKOTW1 质粒寻找孔中有单个细胞的孔并做标记，等做标记的孔长满后，消化、转移到4孔或6孔培养板中，最后转移到培养瓶中培养，冻存，鉴定。

6、鉴定成功后，建议马上做后续实验，因为在培养过程或冻存中，转进去的基因容易从细胞中掉下来。XY880916 96孔板质粒DNAOUT(离心法 ) 1次

XY870903 一步法质粒 DNAOUT 2.0 50次|100次

XY880201 一步法无内毒素质粒DNAOUT 50次

XY871101 一步法大提质粒DNAOUT 5次

XY880917 一步法96孔板质粒DNAOUT(离心法) 1次

XY870804 一步法单菌落质粒 DNAOUT 50次

XY880932 一步法96孔板单菌落质粒DNAOUT(离心法) 1次|5次

XY861202 一步式广谱DNAOUT 10mL

XY880930 微量样品核酸提取试剂盒 50次|200次

XY8121001 液体样品DNAOUT 50次

XY860607 液相内毒素清除剂 100次|500次

XY860608 固相内毒素清除剂 100g|500g

XY8130501 柱式内毒素清除剂 1.5mL

XY8130419 内毒素清除专用亲和介质 5mL|50mL

XY8120415 终点显色法内毒素定量试剂盒 32次

XY8130504 凝胶法内毒素半定量试剂盒 10×0.1mL

XY851203 非酶RNA清除剂1.0 1.5mL

XY860912 非酶RNA清除剂2.0 1.5mL

XY860801 柱式腐殖酸清除剂 30次|100次

XY8111008 非酶多糖清除剂(DNA专用) 50次

XY860804 PCR抑制物清除剂 1mL

XY860911 硅胶膜离心吸附柱系列(小提) 50套

XY890303 硅胶膜DNA离心吸附柱(大提) 1套

XY860606 硅胶膜离心吸附柱再生液 500次

XY8100307 酸洗玻璃珠系列 10g