1、用pLKO.3G 质粒先做一下转化，把质粒转入感受态细胞内

2、将菌液涂到LB平板上倒置、过夜培养

3、挑取单克隆菌落，打入5毫升左右的液体LB，摇床12-16小时，吸取两毫升左右菌液，做一个小提，测浓度，跑胶，4、确定提出来之后，再用剩余菌液按1:100比例加入液体LB，摇床12-16小时

5、摇床结束后，用去内毒素的中提或者大提，可以留几毫升菌液加入适量甘油制成甘油菌冻-80，提出来的pLKO.3G 质粒就可以用于转染了。

如果想直接用甘油菌，那么只需要做第四第五步就行。

以Invitrogen的Lipofectamine 2000为例，需要注意以下几点：

1、DNA的量：Lipofectamine 2000=1：2~3

2、细胞密度大约占培养板的80%左右，转染。

3、转染期间不要加抗生素，否则会导致细胞死亡。

pLKO.3G 质粒步骤如下：以24孔培养板为例：

1、转染前一天细胞换新的培养基

2、制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，如下:

a、用50ul无血清培养基稀释DNA（0.8g），轻轻混匀；

b、Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用48ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5分钟；

c、将a+b的液体加在一起，pLKO.3G 质粒轻轻混匀，室温孵育20分钟，使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成；

3、将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中，轻轻前后摇匀；

4、放入37度孵箱中培养24~48h后，1：10传代，加入G418筛选。加入G418的量最好设几个梯度或者转染前做MTT，找好G418对你所转细胞致死量的浓度。

5、等细胞在G418作用下，长满后冻存几支（保种）。再克隆化培养：将细胞消化后计数50个细胞，加入22ml完全培养基中，混匀，分装在96孔板中（200ul/孔）。第二天在显微镜下，pLKO.3G 质粒寻找孔中有单个细胞的孔并做标记，等做标记的孔长满后，消化、转移到4孔或6孔培养板中，最后转移到培养瓶中培养，冻存，鉴定。

6、鉴定成功后，建议马上做后续实验，因为在培养过程或冻存中，转进去的基因容易从细胞中掉下来。XY80906 一站式大提柱式miRNAOUT 5次

XY80908 一站式动物mRNAOUT 25次

XY130512 一站式磁珠法动物mRNAOUT 50次

XY81108 一站式全血mRNAOUT 25次

XY81028 一站式植物mRNAOUT 25次

XY81103 一站式真菌mRNAOUT 25次

XY80817 mRNA提取试剂盒 25次

XY131231 Oligo(dT)纤维素 25mg

XY130976 Oligo(dT)再生溶液 100mL

XY130977 生物素化的Oligo(dT) 5ug

XY130521 链霉亲和素磁珠 2mL

XY3090 固相RNase清除剂 100mL|250mL

XY130983 气相RNase清除剂 120mL

XY3091 液相RNase清除剂 1.5mL

XY3110 氧钒核糖核苷复合物 10mL

XY3100 RNA长效保存液 1.5mL

XY3290 RNase抑制剂(人源) 400U|2500U

XY130699 RNase 抑制剂(小鼠源) 3000U

XY60201 非酶DNA清除剂 1.5mL

XY70801 非酶DNA清除剂-2 15次

XY90318 柱式DNA清除剂 50次

XY90802 大提柱式DNA清除剂 5次

XY90903 无RNase的DNase溶液 300U

XY90904 膜结合DNA清除试剂盒 50次

XY60204 非酶多糖清除剂(RNA专用) 10mL

XY100802 重蒸酚 100mL

XY3190 水饱和酚 100mL

XY3191 Tris饱和酚 100mL

XY100803 酸酚 100mL

XY100804 氯仿-异戊醇混合液 100mL

XY100805 酚-氯仿-异戊醇混合液 100mL

XY100935 超纯水 100mL

XY60604 DEPC水 100mL

XY80403 RNase-free水 10mL

XY71207 RNA洗脱液 50mL

蛋白质研究