1、用pMAMPF3先做一下转化，把质粒转入感受态细胞内

2、将菌液涂到LB平板上倒置、过夜培养

3、挑取单克隆菌落，打入5毫升左右的液体LB，摇床12-16小时，吸取两毫升左右菌液，做一个小提，测浓度，跑胶，4、确定提出来之后，再用剩余菌液按1:100比例加入液体LB，摇床12-16小时

5、摇床结束后，用去内毒素的中提或者大提，可以留几毫升菌液加入适量甘油制成甘油菌冻-80，提出来的pMAMPF3就可以用于转染了。

如果想直接用甘油菌，那么只需要做第四第五步就行。

以Invitrogen的Lipofectamine 2000为例，需要注意以下几点：

1、DNA的量：Lipofectamine 2000=1：2~3

2、细胞密度大约占培养板的80%左右，转染。

3、转染期间不要加抗生素，否则会导致细胞死亡。

pMAMPF3步骤如下：以24孔培养板为例：

1、转染前一天细胞换新的培养基

2、制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，如下:

a、用50ul无血清培养基稀释DNA（0.8g），轻轻混匀；

b、Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用48ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5分钟；

c、将a+b的液体加在一起，pMAMPF3轻轻混匀，室温孵育20分钟，使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成；

3、将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中，轻轻前后摇匀；

4、放入37度孵箱中培养24~48h后，1：10传代，加入G418筛选。加入G418的量最好设几个梯度或者转染前做MTT，找好G418对你所转细胞致死量的浓度。

5、等细胞在G418作用下，长满后冻存几支（保种）。再克隆化培养：将细胞消化后计数50个细胞，加入22ml完全培养基中，混匀，分装在96孔板中（200ul/孔）。第二天在显微镜下，pMAMPF3寻找孔中有单个细胞的孔并做标记，等做标记的孔长满后，消化、转移到4孔或6孔培养板中，最后转移到培养瓶中培养，冻存，鉴定。

6、鉴定成功后，建议马上做后续实验，因为在培养过程或冻存中，转进去的基因容易从细胞中掉下来。XY90603随机引物法DNA探针标记试剂盒5次(A)XY90604PCR法DNA探针标记试剂盒5次(A)XY90605TdT加尾法DNA探针标记试剂盒5次(A)XY131036DNA 5’末端标记试剂盒10次XY100210dNTP溶液(标记专用)0.5mLXY100920生物素标记dUTP溶液50μLXY100921地高辛标记dUTP溶液25μLXY120631Aminoally-dUTP溶液100μLXY120630Fluorescein -12- dUTP溶液25μLXY130995Cy3-dCTP溶液25μLXY130996Cy5-dCTP溶液25μLXY121122柱式探针纯化试剂盒10次XY121110超快核酸转膜试剂盒5次(A)|5次(B)XY70104核酸印迹膜染液100mLXY80915超级杂交液100mL(A)|100mL(B)XY130904超级杂交液(Oligo探针)10mLXY130905超级杂交液(芯片)10mLXY130906超级杂交液(原位杂交)10mLXY131208DNA探针变性液10mLXY100405SSC溶液，20×100mLXY100809SSPE溶液，20×100mLXY70907去离子甲酰胺100mLXY100812BLOTTO溶液100mLXY70904酵母tRNA溶液1.5mL(A)|1.5mL(B)XY91104Denhardt溶液，50×100mL(A)|100mL(B)XY100604鲑鱼精DNA溶液1mLXY130908鲱鱼精DNA溶液1mLXY131207小牛胸腺DNA溶液1mLXY130810荧光尺1个XY120643硫酸葡聚糖1gXY120644聚乙二醇100gXY120674酪蛋白50gXY130907脱脂奶粉(杂交专用)50gXY120676Southern封堵液(NC专用)50mLXY120677Southern封堵液(Nylon专用)50mLXY100930**纤维素膜1张(A)|1张(B)XY120930分子杂交炉1台XY120931紫外交联仪1台XY121114非同位素探针杂交试剂盒5次(A)|5次(B)XY100847BCIP-NBT法地高辛杂交检测试剂盒5次XY100848ECL法地高辛杂交检测试剂盒5次XY131001AP标记的抗地高辛抗体10μLXY131002AP标记的抗生物素抗体10μLXY131003HRP标记的抗地高辛抗体10μLXY131004HRP标记的抗生物素抗体10μLXY130807显影定影试剂盒1套XY130808显影粉1袋XY130809定影粉1袋XY131117DNA 包被溶液100mLXY1311654× 核酸液相杂交液10mLXY121206DNA 稀释液10mL

细胞及免疫学