1、用pMCSG30质粒先做一下转化，把质粒转入感受态细胞内

2、将菌液涂到LB平板上倒置、过夜培养

3、挑取单克隆菌落，打入5毫升左右的液体LB，摇床12-16小时，吸取两毫升左右菌液，做一个小提，测浓度，跑胶，4、确定提出来之后，再用剩余菌液按1:100比例加入液体LB，摇床12-16小时

5、摇床结束后，用去内毒素的中提或者大提，可以留几毫升菌液加入适量甘油制成甘油菌冻-80，提出来的pMCSG30质粒就可以用于转染了。

如果想直接用甘油菌，那么只需要做第四第五步就行。

以Invitrogen的Lipofectamine 2000为例，需要注意以下几点：

1、DNA的量：Lipofectamine 2000=1：2~3

2、细胞密度大约占培养板的80%左右，转染。

3、转染期间不要加抗生素，否则会导致细胞死亡。

pMCSG30质粒步骤如下：以24孔培养板为例：

1、转染前一天细胞换新的培养基

2、制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，如下:

a、用50ul无血清培养基稀释DNA（0.8g），轻轻混匀；

b、Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用48ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5分钟；

c、将a+b的液体加在一起，pMCSG30质粒轻轻混匀，室温孵育20分钟，使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成；

3、将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中，轻轻前后摇匀；

4、放入37度孵箱中培养24~48h后，1：10传代，加入G418筛选。加入G418的量最好设几个梯度或者转染前做MTT，找好G418对你所转细胞致死量的浓度。

5、等细胞在G418作用下，长满后冻存几支（保种）。再克隆化培养：将细胞消化后计数50个细胞，加入22ml完全培养基中，混匀，分装在96孔板中（200ul/孔）。第二天在显微镜下，pMCSG30质粒寻找孔中有单个细胞的孔并做标记，等做标记的孔长满后，消化、转移到4孔或6孔培养板中，最后转移到培养瓶中培养，冻存，鉴定。

6、鉴定成功后，建议马上做后续实验，因为在培养过程或冻存中，转进去的基因容易从细胞中掉下来。XY100806Earle溶液100mLXY91105Hanks溶液100mLXY100927D-Hanks溶液100mLXY100215PBS缓冲液(10×)250mLXY100807杜氏PBS溶液，10×100mLXY90306胰酶消化液250mL(A)|250mL(B)XY100301秋水仙素溶液1mLXY130819Bouin固定液2LXY131223Zenker固定液2LXY131224Helly固定液2LXY131225Carnoy固定液2LXY131200细胞计数液(Vi-CELL仪专用)100次XYpyj19细胞培养基1套XYygtz22荧光探针和示踪剂1瓶XYfly100细胞分离液1瓶XYydyz23细胞凋亡诱导剂和抑制剂1瓶XY100407人淋巴细胞分离液A型100mLXY90307青链霉素溶液100mLXY131134Percoll100mLXY131136Ficoll-Paque介质100mLXY100601细胞核微量制备试剂盒50次XY111207动物线粒体纯化试剂盒15次(A)|15次(B)XY111208植物线粒体纯化试剂盒15次(A)|15次(B)XY120308植物叶绿体纯化试剂盒15次XY100410超快转染试剂盒1mLXY130821阿尔玛蓝细胞增殖与细胞毒检测试剂100次|500次XY111105MTT检测试剂盒500次XY121205CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂盒5mLXY81026一站式生物素检测TUNEL试剂盒(DAB法)10次XY81025双染细胞凋亡检测试剂盒25次|50次XY130596荧光染色细胞凋亡检测试剂盒200次XY130862DAPI干粉10mgXY130863碘化丙啶干粉10mgXY130864Hoechst 33258干粉10mgXY130865Hoechst 33342干粉10mgXY130595双荧光素酶活性检测试剂盒100次XY130597萤火虫荧光素酶活性检测试剂盒100次XY130598海肾荧光素酶活性检测试剂盒100次XY131012萤火虫荧光素1mLXY131019无内毒素萤火虫荧光素25mgXY130599β-半乳糖苷酶活性检测试剂盒300次XY130802ADP/ATP发光法细胞活力检测试剂盒200次XY130801ATP发光法细胞活力检测试剂盒200次XY121104增强型天狼猩红染色试剂盒100mLXY121105茜素红S染色试剂盒100mLXY130822苏木素染色液15ml

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