1、用pNN_v2 质粒先做一下转化，把质粒转入感受态细胞内

2、将菌液涂到LB平板上倒置、过夜培养

3、挑取单克隆菌落，打入5毫升左右的液体LB，摇床12-16小时，吸取两毫升左右菌液，做一个小提，测浓度，跑胶，4、确定提出来之后，再用剩余菌液按1:100比例加入液体LB，摇床12-16小时

5、摇床结束后，用去内毒素的中提或者大提，可以留几毫升菌液加入适量甘油制成甘油菌冻-80，提出来的pNN_v2 质粒就可以用于转染了。

如果想直接用甘油菌，那么只需要做第四第五步就行。

以Invitrogen的Lipofectamine 2000为例，需要注意以下几点：

1、DNA的量：Lipofectamine 2000=1：2~3

2、细胞密度大约占培养板的80%左右，转染。

3、转染期间不要加抗生素，否则会导致细胞死亡。

pNN_v2 质粒步骤如下：以24孔培养板为例：

1、转染前一天细胞换新的培养基

2、制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，如下:

a、用50ul无血清培养基稀释DNA（0.8g），轻轻混匀；

b、Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用48ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5分钟；

c、将a+b的液体加在一起，pNN_v2 质粒轻轻混匀，室温孵育20分钟，使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成；

3、将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中，轻轻前后摇匀；

4、放入37度孵箱中培养24~48h后，1：10传代，加入G418筛选。加入G418的量最好设几个梯度或者转染前做MTT，找好G418对你所转细胞致死量的浓度。

5、等细胞在G418作用下，长满后冻存几支（保种）。再克隆化培养：将细胞消化后计数50个细胞，加入22ml完全培养基中，混匀，分装在96孔板中（200ul/孔）。第二天在显微镜下，pNN_v2 质粒寻找孔中有单个细胞的孔并做标记，等做标记的孔长满后，消化、转移到4孔或6孔培养板中，最后转移到培养瓶中培养，冻存，鉴定。

6、鉴定成功后，建议马上做后续实验，因为在培养过程或冻存中，转进去的基因容易从细胞中掉下来。XY001 肉毒杆8种通用型试剂盒 48次/盒

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