产品内容：
提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体20 mL×1瓶，4℃保存；   
试剂二：粉剂×1支，-20℃保存； 
试剂三：液体×1支，4℃保存；
产品说明：
PK（EC 2.7.1.40）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化糖酵解过程中的最后一步反应，是糖酵解过程中的主要限速酶之一，也是产生ATP的关键酶之一，因此测定PK活性具有重要意义。
PK催化磷酸烯醇式丙酮酸和ADP生成ATP和丙酮酸，乳酸脱氢酶进一步催化NADH和丙酮酸生成乳酸和NAD+，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PK活性。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研钵、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本的前处理
1、 细菌或培养细胞：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500-1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或者200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、 组织：
    按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1:5-10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
3、 血清（浆）样品：直接检测。
二、测定步骤及加样表：
1. 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
2. 样本测定
（1） 在试剂二瓶中加入17ml试剂一和1ml蒸馏水充分溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴5分钟，现配现用。
（2） 在试剂三中加入1ml蒸馏水充分溶解，冰上放置备用，现配现用。
（3） 在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂三和180μL试剂二，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A1和2min20s后的吸光值A2，计算△A=A1-A2.
PK活力单位的计算：
A．用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
1、 血清（浆）PK活力的计算：
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。
PK（U/mL）=[△A×V反总÷（ε×d）×109] ÷V样÷T=1608×△A
2、 组织、细菌或细胞中PK活力的计算: 
（1） 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。
PK（U/mg prot）＝[△A×V反总÷（ε×d）×109] ÷(Cpr×V样)÷T=1608×△A ÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。
PK（U/g 鲜重）＝[△A×V反总÷（ε×d）×109] ÷(W×V样÷V样总)÷T=1608×△A ÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。
PK（U/104 cell）＝[△A×V反总÷（ε×d）×109] ÷(500×V样÷V样总)÷T=3.216×△A
V反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
B． 用96孔板测定的计算公式如下：
1、 血清（浆）PK活力的计算： 
单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。
PK（U/mL）=[△A×V反总÷（ε×d）×109] ÷V样÷T=2680×△A
2、 组织、细菌或细胞中PK活力的计算: 
（1） 按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。
PK（U/mg prot）＝[△A×V反总÷（ε×d）×109] ÷(Cpr×V样)÷T=2680×△A ÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。
PK（U/g 鲜重）＝[△A×V反总÷（ε×d）×109] ÷(W×V样÷V样总)÷T=2680×△A ÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗1nmolNADH定义为一个酶活力单位。
PK（U/104 cell）＝[△A×V反总÷（ε×d）×109] ÷(500×V样÷V样总)÷T=5.36×△A
V反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光径，0.6cm；V样：加入样本体积，0.01mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
注意事项：
1、 测定过程中试剂三、样本在冰上放置，以免变性和失活。
2、 比色皿中反应液的温度尽量保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3、 最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
相关文献：
《Galangin and Pinocembrin from Propolis Ameliorate Insulin Resistance in HepG2 Cells via Regulating Akt/mTOR Signaling》 作者:Yinkang Liu, Xiali Liang,Gensheng Zhang,Lingjie Kong,Wenjun Peng and Hongcheng Zhang 期刊:Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 影响因子:1.984 PMID:30420897