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己糖激酶测定试剂盒 微量法

己糖激酶测定试剂盒 微量法

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产品名称: 己糖激酶测定试剂盒 微量法

英文名称: Micro Hexokinase(HK) Assay Kit

产品编号: BC0745

产品价格: 0

产品产地: 北京市通州区马驹桥联东U谷85A三

品牌商标: Solarbio

更新时间: 2023-08-11T10:26:26

使用范围: null

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产品内容:

提取液:液体100mL×1 瓶,4保存;

试剂一:液体20mL×1 瓶, 4保存;

试剂二:粉剂×1 瓶,4保存;

试剂三:粉剂×1 支,-20保存;

产品说明

HK广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是葡萄糖分解过程中的第一个关键酶,催化葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交叉点。

HK催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADPH NADPH 340nm有特征吸收峰。

试验中所需的仪器和试剂:

紫外分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板UV板)、研钵、冰。

操作步骤:

一、样品测定的准备:   

1. 细菌或培养细胞:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清,按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500-1000:1 的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次),8000g 4离心10min,取上清,置冰上待测。

2. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5-10 的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆;8000g 4离心10min,取上清,置冰上待测。

3. 血清(浆)样品:直接检测。

二、测定操作:

1、 分光光度计或酶标仪预热30min 以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2、 样本测定

1)在试剂二中加入18mL 试剂一充分溶解,置于37(哺乳动物)或25(其它物种)水浴5min;用不完的试剂4保存一周;

2)在试剂三中加入1mL 试剂一,充分溶解待用;用不完的试剂4保存一周;

3)在微量石英比色皿或96 孔板中加入180μL 试剂二、10μL 试剂三和10μL 样本,混匀,立即记录340nm 20s 时的吸光值A1,比色后迅速将比色皿或酶标板连同反应液一起放入37(哺乳动物)或25(其它物种)水浴或恒温箱中,准确反应5分钟;迅速取出比色皿并擦干,340 nm下比色,记录520秒时的吸光度A2,计算ΔA=A2-A1

注意事项 

1、比色皿中反应液的温度必须保持3725,取小烧杯一只装入一定量的3725蒸馏水,将此烧杯放入3725水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

2、最好两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。

3、不同匀浆组织中HK 活力不一样,做正式试验之前请做1-2 只预试,若ΔA>0.5,则说明组织活力太高,必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液(计算公式中乘以相应稀释倍数),或缩短反应时间至2min,使ΔA<0.5,以提高检测灵敏度。

HK活性计算:   

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、 血清(浆)HK 活性

单位的定义:每毫升血清(浆)在每分钟生成1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

HKU/mL)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷V ÷T=643×ΔA

2、 组织、细菌或细胞中HK 活性

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg 组织蛋白每分钟生成1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

HKU/mg prot)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷(V ×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g 组织每分钟生成1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

HKU/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷(W ×V ÷V 样总) ÷T=643×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1 万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

HKU/104 cell)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷(500×V ÷V 样总) ÷T=1.286×ΔA

V 反总:反应体系总体积,2×10-4 LεNADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cmd:比色皿光径,1cm

V 样:加入样本体积,0.01 mLV 样总:加入提取液体积,1 mLT:反应时间,5 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细菌或细胞总数,500 万。

b.96 孔板测定的计算公式如下

1、 血清(浆)HK 活性

单位的定义:每毫升血清(浆)在每分钟生成1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

HKU/mL)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷V ÷T=1071.7×ΔA

2、 组织、细菌或细胞中HK 活性

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每mg 组织蛋白每分钟生成1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

HKU/mg prot)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷(V ×Cpr) ÷T=1071.7×ΔA÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每g 组织每分钟生成1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

HKU/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷(W× V ÷V 样总) ÷T=1071.7×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1 万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

HKU/104 cell)=[ΔA×V 反总÷ε×d×109]÷(500×V ÷V 样总)÷T=2.143×ΔA

V 反总:反应体系总体积,2×10-4 LεNADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cmd96 孔板光径,0.6cmV 样:加入样本体积,0.01 mLV 样总:加入提取液体积,1 mLT:反应时间,5 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细菌或细胞总数,500 万。

相关文献:

《Effects of validamycin in controlling Fusarium head blight caused by Fusarium graminearum: Inhibition of DON biosynthesis and induction of host resistance》 作者:Jing Li,Yabing Duan,Chuanhong Bian,Xiayan Pan,Chengjie Yao,Jianxin Wang,Mingguo Zhou 期刊:Pesticide Biochemistry and Physiology 影响因子:2.87 PMID:30744889
《Galangin and Pinocembrin from Propolis Ameliorate Insulin Resistance in HepG2 Cells via Regulating Akt/mTOR Signaling》 作者:Yinkang Liu, Xiali Liang,Gensheng Zhang,Lingjie Kong,Wenjun Peng and Hongcheng Zhang 期刊:Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine 影响因子:1.984 PMID:30420897