乙酸激酶测定试剂盒北京索莱宝科技有限公司

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性能参数

产品名称: 乙酸激酶测定试剂盒
英文名称: Acetokinase(ACK)Assay Kit
产品货号: BC3170
产品规格: 50管/48样
产品产地: 北京市通州区马驹桥联东U谷85A三
产品商标: Solarbio
价    格: 2610元
保存与运输: 4℃保存或-20℃保存;
现货状态: 现货
产品资料: 实验方法技术资料
更新时间: 2019/9/11 8:35:00
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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北京索莱宝科技有限公司
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产品详细描述

乙酸激酶测定试剂盒产品内容:

提取液:液体50mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体30mL×1瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存;临用前每瓶加入4mL双蒸水,充分溶解待用。用不完的试剂仍4℃保存;

试剂三:粉剂×2瓶,-20℃保存;临用前每瓶加入3mL双蒸水,充分溶解待用;用不完的试剂-20℃保存;

试剂四:粉剂×2瓶,-20℃保存;临用前每瓶加入2mL双蒸水,充分溶解待用;用不完的试剂-20℃保存;

试剂五:粉剂×1支,-20℃保存;临用前每支加入1mL双蒸水,充分溶解待用;用不完的试剂-20℃保存;

试剂六:液体43μL×2支,4℃保存;临用前每支加入457μL双蒸水,充分溶解待用;用不完的试剂4℃保存;

试剂七:液体50μL×2支,-20℃保存;临用前每支加入450μL双蒸水,充分溶解待用;用不完的试剂仍4℃保存;

试剂八:粉剂×1瓶,4℃保存;临用前加入5mL双蒸水,充分溶解待用。用不完的试剂仍4℃保存。

工作液:吸取0.3mL 试剂二、1mL试剂三、0.65mL试剂四、0.2mL试剂五、0.2mL试剂六、0.2mL试剂七、1mL试剂八混匀,也可根据比例现用现配。于冰上备用。

产品说明:

ACK广泛存在于生物体内,催化乙酸和ATP生成乙酰***酸和ADP,是细菌碳代谢和能量代谢的关键酶,尤其是在古细菌甲烷合成代谢中起着中枢作用。

测定原理如下:(1ACK催化乙酸钠和ATP生成乙酰***酸和ADP,(2)丙***酸激酶催化ADPPEP生成ATP和丙***酸,(3)乳酸脱氢酶催化丙***酸和NADH生成乳酸和NAD+,(4)在340nm下测定NADH氧化生成NAD+速率,即可反映ACK活性。

自备实验用品及仪器

  台式离心机、紫外分光光度计、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。

 

乙酸激酶测定试剂盒操作步骤:

一、样品前处理:

1、细菌或细胞处理:

收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率20%,超声3秒,间隔10秒,重复30次),15000g4℃,离心20分钟,取上清,置冰上待测。

2、组织处理:

称取约0.1g组织,加入1mL提取液进行冰浴匀浆;15000g 4℃,离心20分钟,取上清,置冰上待测

3、血清(浆):直接检测。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2、 将试剂一于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)保温15min

3、 操作表:

试剂

测定管

空白管

蒸馏水

-

100

试剂一(μL

545

545

工作液μL

355

355

样本(μL

100

-

将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中,加样本的同时开始计时,在340nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1,比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴中准确反应3分钟;迅速取出比色皿并擦干,340 nm下比色,记录320秒时的吸光度A2,计算ΔA测定=A测定1-A测定2ΔA空白=A空白1-A空白2计算ΔA=ΔA测定-ΔA空白。

三、乙酸激酶测定试剂盒ACK活性计算:

1、 组织中ACK活力的计算:

1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmolNADH定义为一个酶活力单位。

ACKU/mg prot=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(Cpr×V) ÷T=536×ΔA÷Cpr

2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟消耗1 nmolNADH定义为一个酶活力单位。

ACKU/g 鲜重)= [ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(V÷V提取×W) ÷T=536×ΔA÷W

3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmolNADH定义为一个酶活力单位。

ACKU/104 cell=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷(V÷V样总×500) ÷T=1.072×ΔA

4)按血清体积计算:

单位的定义:每mL血清(浆)中消耗1 nmolNADH定义为一个酶活力单位。

ACKU/mL=[ΔA×V反总÷ε×d×109]÷V÷T=536×ΔA

V反总:反应体系总体积,0.001LεNADH摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cmd:比色皿光径,1cm          V样:加入样本体积,0.1 mLV提取:加入提取液体积,1 mLT:反应时间,3 minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样品质量,g500:细菌或细胞总数,500万。

注意事项

1、测定过程中样本和所有试剂在冰上放置,以免变性和失活。

2、比色皿中反应液的温度必须保持37℃25℃,取小烧杯一只装入一定量的37℃25℃蒸馏水,将此烧杯放入37℃25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3、吸光值大于1时,建议稀释后测量,注意计算公式乘以稀释倍数;吸光值小于0.01时,建议延长反应时间测量,注意计算公式变化。

  

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