Hieff  NGSTM OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina上海前尘生物科技有限公司

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性能参数

产品名称: Hieff  NGSTM OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina
英文名称: Hieff  NGSTM OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina
产品货号: 12203ES08
产品规格: 8 libraries
产品产地: Yeasen
产品商标: Yeasen
价    格: 3656.00元
保存与运输: 冰袋运输。所有组分-20°C保存,有效期1年。
产品资料: 实验方法技术资料
更新时间: 2018/9/14 13:17:00
浏览人数:12
诚信指数:824点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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产品详细描述

Hieff  NGSTM OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina

产品信息

产品名称

产品编号

规格

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价格(元)

Hieff NGSTM OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina®

12203ES08

8 libraries

-20℃

3656.00

12203ES24

24 libraries

-20℃

7486.00

12203ES96

96 libraries

-20℃

28567.00

产品描述

Hieff NGSTM OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina®是针对Illumina®高通量测序平台专业开发设计的新一代酶切法建库试剂盒。与传统的建库法比较,本品采用高质量的酶学组成,摆脱了繁琐的超声过程,具有优秀的文库转化率与扩增效率,可应用于常规动植物基因组、微生物基因组等样本的建库。经测序验证,不同GC含量的样本,均可获得优异的测序结果,文库覆盖高,均一性好,偏好性低,使建库变得更加简单。
 
一、关于操作
1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。
3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡,剧烈振荡可能会造成文库产出下降。
4. 为避免样品交叉污染,推荐使用带滤芯的枪头,吸取不同样品时请更换枪头。
5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。
6. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染,进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离;使用专用的移液器等设备;并定时对各实验区域进行清洁(使用0.5%次**钠或10%漂白剂进行擦拭清理),以保证实验环境的洁净度。
二、关于DN**段化
1. 本试剂盒为酶切法片段化DNA。
2. 本试剂盒兼容范围为500 pg – 100 ng Input DNA。应尽可能使用A260/A280 = 1.8-2.0的高质量Input DNA。
3. Input DNA中引入高浓度金属离子螯合剂或其他盐,可能会影响后续实验,建议将DNA稀释在TE Buffer中进行片段化。请勿使用EDTA终止反应,65℃加热即可使片段化酶失活。
4. 参照片段化步骤可将DNA酶切为150-550 bp左右,为保证优质稳定的片段化效果,片段化过程请于冰上操作。
三、关于接头连接(Adapter Ligation)
1. 针对Illumina®测序平台,Yeasen提供48种Indexed Adapters:Cat#12615,Hieff NGSTM Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1(12种);Cat#12616,Hieff NGSTM Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 2(12种);Cat#12617,Hieff NGSTM Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 3(12种);Cat#12618,Hieff NGSTM Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 4(12种)。
2. Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。Adapter用量过高可能会产生较多Adapter Dimer;用量较低可能会影响连接效率及文库产量。表1列举了使用本试剂盒,不同Input DNA量推荐的Adapter使用量。
四、关于磁珠纯化与分选(Bead-based Clean Up and Size Selection)
1. DN**段长度分选步骤可选择在末端修复/dA尾添加之前,或接头连接后,或文库扩增后进行。
2. 当Input DNA质量≥50 ng,您可选择在接头连接后分选;如Input DNA质量<50 ng,建议您在文库扩增后进行分选。
3. Ligation Enhancer中包含高浓度的PEG,会对双轮分选产生显著影响。因此,如在接头连接后进行长度分选,必须先进行纯化步骤,再进行双轮分选步骤;如在末端修复/dA尾添加之前或文库扩增后进行长度分选,可直接进行双轮磁珠分选步骤。
4. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致得率下降、分选效果不佳。
5. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。
6. 转移上清时,请勿吸取磁珠,即使微量残留都将影响后续文库质量。
7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。
8. 进行长度分选时,初始样品体积应尽量≥100 μL,不足时请用超纯水补齐。以防因样品体积太小导致移液误差增大。
9. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。
10. DNA纯化或长度分选产物如需保存,可使用TE Buffer洗脱,产物可于4°C可保存1-2周,-20°C可保存1个月。
五、关于文库扩增(Library Amplification)
文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足,将导致文库产量低;循环数过多,又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒,获得600 ng文库的推荐循环数。
六、关于文库质检(Library Quality Analysis)
1. 通常情况下,构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。
2. 文库浓度检测可使用:基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit®、PicoGreen®等;基于qPCR绝对定量的方法。
3. 文库浓度检测不可使用:基于光谱检测的方法,如NanoDrop®等。
4. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测:Qubit®、PicoGreen®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时,无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物以及其他不完整双链结构产物;qPCR绝对定量基于PCR扩增原理,仅定量样品中两端Adapter完整的文库(即可测序的文库),可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。
5. 文库长度分布检测,可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。
使用方法
一、自备材料
1. 纯化磁珠:Cat#12601,Hieff NGSTM DNA Selection Beads或Cat#A63880,AMPure XP Beads或其他等效产品。
2. DNA质控:Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效产品。
3. DNA Adapter:可选Yeasen Cat#12615,Hieff NGSTM Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1;Cat#12616,Hieff NGSTM Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 2;Cat#12617,Hieff NGSTM Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 3;Cat#12618,Hieff NGSTM Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 4;或其他等效产品。
4. 其他材料:无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer(10 mM Tris-HCl,pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA)、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。
二、操作流程
三、操作步骤
3.1 DN**段化(DNA Fragment)
该步骤将基因组DN**段化,片段化之后加热使酶失活。
1. 将表3中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。
2. 于冰上配制表3反应体系。
3.2 末端修复/dA尾添加(End Preparation/dA-Taling)
该步骤将片段化DNA进行末端修复和dA尾添加。
1. 将表5中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。
2. 于无菌PCR管中配制表5所示反应体系。
3.3 接头连接(Adapter Ligation)
该步骤将3.2步骤的产物末端,连接特定的Illumina®接头。
1. 根据Input DNA量按表1稀释Adapter至合适浓度。
2. 将表7中各试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。
3. 于3.2步骤PCR管中配制表7所示反应体系。
3.4 连接产物磁珠纯化(Post Ligation Clean Up)
该步骤使用磁珠对3.3步骤的产物进行纯化或分选。纯化可除去未连接的Adapter或Adapter Dimer等无效产物。
3.4.1 纯化操作步骤:
1. 准备工作:将Hieff NGSTM DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。
3. 吸取80 μL Hieff NGSTM DNA Selection Beads(0.8×,Beads:DNA=0.8:1)至Adapter Ligation产物中,室温孵育5 min。
4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。
5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。
6. 重复步骤5,总计漂洗两次。
7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。
8. 将PCR管从磁力架中取出,进行洗脱:
1)如产物无需进行片段分选,直接加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。【注:如纯化产物如需保存,可使用TE Buffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取20 μL上清至新PCR管中,切勿触碰磁珠。
2)如产物需进行双轮分选,加入102 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。【注:如纯化产物如需保存,可使用TE Buffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取100 μL上清至新PCR管中,切勿触碰磁珠。
3.4.2 双轮分选操作步骤:
1. 准备工作:将Hieff NGSTM DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡约30 min。配制80%乙醇。
2. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。
3. 根据DN**段长度要求,参考表9向上述100 μL DNA上清中加入第一轮分选磁珠,涡旋混匀或移液器吹打10次混匀。
4. 室温孵育5 min。
5. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心转移上清到干净的离心管中。
6. 参考表9向上清中加入第二轮分选磁珠。
7. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀,室温静置5 min。
8. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。
9. 保持PCR管始终处于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec,小心移除上清。
10. 重复步骤9。
11. 保持PCR管始终处于磁力架中,开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂(约5 min)。
12. 将PCR管从磁力架中取出,加入适量21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀,室温静置5 min。
13. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约5 min),小心转移20 μL上清至干净的管中。
3.5 文库扩增(Library Amplification)
该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。
1. 将表10中试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。
2. 于无菌PCR管中配制表10所示反应体系。
3.6 扩增产物磁珠纯化或分选(Post Amplification Clean Up/Size Selection)
同3.4.1步骤中纯化操作步骤。使用Hieff NGSTM DNA Selection Beads(0.9×,Beads:DNA=0.9:1)纯化文库扩增产物。
如需分选,操作方法同3.4.2双轮分选步骤(纯化步骤可省略)。
3.7 文库质量控制
通常情况下,构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价,具体请参见注意事项六。
3.8 参考实例
使用Hieff NGSTM OnePot DNA Library Prep Kit for Illumina®对50 ng Human gDNA样本建库(0.7× 0.2×双轮分选),结果使用Agilent 2100 DNA 1000 Chip进行检测。
 
 
 
 
 
 

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