氨基比林-N-去甲基化酶(AND)测试盒上海雅吉生物科技有限公司

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性能参数

产品名称: 氨基比林-N-去甲基化酶(AND)测试盒
英文名称: Pyramidon-N-Methylase(AND) Assay Kit
产品货号: YS29250
产品规格: T25
试剂级别: 细胞培养级
产品产地: 中国
产品商标: 雅吉生物
价    格: 询价元
保存与运输: 室温
现货状态: 1000瓶
产品资料: 实验方法技术资料
更新时间: 2021/1/22 13:54:00
浏览人数:16
诚信指数:661点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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上海雅吉生物科技有限公司
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联系人:
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产品详细描述

 注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

氨基比林-N-去甲基化酶(AND)测试盒测定意义:
细胞色素 P450 酶是一组在外源物质代谢中,尤其是药物和毒物,具有重要作用的酶系。AND
作为 P450 酶系的重要一员,相当于 CYP3A4 亚型,与药物的去甲基化反应密切相关。
测定原理:
AND 催化氨基比林释放甲醛,通过 Nash 比色法测定甲醛含量,即可计算出 AND 活性。
自备仪器和用品:
普通离心机,超速离心机、水浴锅、可调式移液枪、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比
色皿/96 孔板、蒸馏水、无水乙醇和冰。
试剂组成和配制:
试剂一:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加 100mL 蒸馏水充分溶解。
试剂二:液体×1 瓶,4℃保存。
试剂三:粉剂×1 管,4℃避光保存。临用前加入 1mL 无水乙醇,充分溶解。
试剂四:粉剂×1 管,4℃保存。临用前加入 0.5mL 蒸馏水,充分溶解。
试剂五:粉剂×1 瓶,室温保存。临用前加蒸馏水 4mL 充分溶解。
试剂六:液体×1 瓶,室温保存。
试剂七:液体×1 瓶,4℃保存。
标准液:液体×1 瓶,-20℃保存。临用前取 1.5mL EP 管,加入 10μl 标准液,加 990μl 蒸馏
水,混匀即为 0.05 mmol/L 标准甲醛溶液,4℃保存。
粗酶液提取:
1、除去细胞核,线粒体等大分子物质:称约 0.5g 组织,加入 1 mL 试剂一,冰上充分研磨,
10 000g 4℃离心 30min,取上清液转入超速离心管。
2、粗制微粒体:4℃,100 000g,离心 60min,弃上清液。
3、除血红蛋白等杂质:向步骤 2 的沉淀中加 1mL 试剂一,盖紧后充分震荡溶解,100 000g
离心 30min,弃上清液。
4、最终微粒体:向步骤 3 的沉淀中加试剂二 0.5 mL,盖紧后充分震荡溶解,即粗酶液,待
测。该待测液需当天使用。
AND 活性测定操作:
1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min,调节波长到 412 nm,蒸馏水调零。
2. 试剂二置于 37℃水浴中预热 30min。
3. 对照管:取 1 支 EP 管,加入 10μL 粗酶液,170μL 试剂二,10μL 试剂三,10μL 蒸馏水,
混匀后置于 37℃水浴保温 30min;立即加入 35μL 试剂五,混匀后置于冰浴中 5min;取出后
加入 35μL 试剂六,混匀后室温静置 5min;室温 8000rpm 离心 5min;取新的 EP 管,加入
100μL 上清液,100μL 试剂七,混匀后 60℃水浴 10min,然后取出,用冷水冷却 5min,于
412nm 测定光吸收,记为 A 对照管。
4. 测定管:取 1 支 EP 管,加入 10μL 粗酶液,170μL 试剂二,10μL 试剂三,10μL 试剂四,
混匀后置于 37℃水浴保温 30min;立即加入 35μL 试剂五,混匀后置于冰浴中 5min;取出后
加入 35μL 试剂六,混匀后室温静置 5min;室温 8000rpm 离心 5min;取 1 支新 EP 管,加入
100μL 上清液,100μL 试剂七,混匀后 60℃水浴 10min,然后取出,用冷水冷却 5min,于
412nm 测定光吸收,记为 A 测定管。

5. 标准管:取 1 支 EP 管,加入 100μL 标准品,100μL 试剂七,混匀后 60℃水浴 10min,然
后取出,用冷水冷却 5min,于 412nm 测定光吸收,记为 A 标准管。
注意:每个样品都需要做对照管。
AND 活性计算:
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1)按蛋白浓度计算
活性单位定义:37℃中每分钟每毫克蛋白催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。
AND 活性(nmol/min prot) = C 标准品× V 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管× 稀
释倍数÷(Cpr×V 样)÷T
= 45×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管÷Cpr。
(2)按样本质量计算
活性单位定义:37℃中每分钟每克组织催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。
AND 活性(nmol/min/g ) = C 标准品×V 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管×稀释倍
数÷(V 样÷V 样总×W)÷T
= 45×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管÷W。
C 标准品:0.05 mmol/L=50μmol/L;V 标准品:500μL=0.0005 L;稀释倍数:V 反总÷V 上清
液=(50+850 +50+50+175+175)÷500=2.7;Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测
定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒;V 样:加入粗酶液体积,50μL=0.05mL;
V 样总:提取液体积,0.5mL;T:催化反应时间(min),30min。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
(1)按蛋白浓度计算
活性单位定义:37℃中每分钟每毫克蛋白催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。
AND 活性(nmol/min prot) = C 标准品×V 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管× 稀
释倍数÷(Cpr×V 样)÷T
= 45×(A 测定管-A 对照管)÷ A 标准管÷ Cpr。
(2)按样本质量计算
活性单位定义:37℃中每分钟每克组织催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。
AND 活性(nmol/min/g ) = C 标准品×V 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷A 标准管×稀释倍
数÷(V 样÷V 样总×W)÷T
= 45×(A 测定管-A 对照管)÷ A 标准管÷W。
C 标准品:0.05 mmol/L=50μmol/L;V 标准品:500μL=0.0005 L;稀释倍数:V 反总÷V 上清
液=(50+850 +50+50+175+175)÷500=2.7;Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测
定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒;V 样:加入粗酶液体积,50μL=0.05mL;
V 样总:提取液体积,0.5 mL;T:催化反应时间(min),30min。
注意事项:
1、粗酶液需在当日完成测定,如需保存,则向粗酶液提取步骤 3 的沉淀中加 0.5ml 20%的
甘油,分装后,-80℃保存;
2、试剂三和试剂四需临用前配制,如当天没有用完,4℃避光保存,可用 1 周;
3、粗酶液可直接用于蛋白浓度测定,建议用 BCA 法测蛋白含量。 

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