产品信息

产品描述

Hieff NGS^® Ultima Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina^®高通量测序平台专门研发的用于mRNA转录组文库构建试剂盒，本试剂盒将cDNA二链合成与Endprep、dA-tailing进行合并，极大地缩减建库时间。二链合成模块配有两种Buffer，客户可根据需要进行常规建库或链特异性建库。本产品适用于起始模板为10 ng-4 μg不同来源真核生物总RNA样本。经过mRNA分离、片段化、双链cDNA合成、末端修复、加A尾、接头连接和文库扩增，总RNA样品最终转化为适用于Illumina^®平台测序的文库。

试剂盒包含两个独立模块，BOX-I的核心为纯化mRNA所需的oligo(dT)磁珠。BOX-II包含mRN**段化试剂，反转录试剂，常规和链特异性ds-cDNA合成，以及后续建库所需的所有试剂。其中链特异性二链合成Buffer中将dTTP替换为dUTP，使cDNA第二链中掺入dUTP，而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板，实现链特异性。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。

产品组分

运输与保存方法

冰袋运输。效期一年。存储温度如下，切不可搞错！

Box I：2-8℃保存；Box II：-20℃保存。

注意事项

一、 关于操作

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

4. 请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用ThermoFisher公司的RNAZap^TM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。

5. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；配备文库构建专用移液器等设备；定时对各实验区域进行清洁（推荐使用ThermoFisher公司的DNAZap^TM高效核酸去除喷雾），以保证实验环境的洁净度。

二、应用范围

本试剂盒适用于起始模板量为10 ng-4 μg（体积≤50 μL）的高质量动物、植物和真菌等真核生物的总RNA。如初始RNA浓度偏低，体积超过50 μL，可使用Hieff NGS^® RNA Cleaner磁珠进行浓缩。RNA需通过Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片检测，RIN值要求＞7，以保证mRNA有完整的poly(A)尾结构。

本试剂盒的mRNA分离模块使用的是oligo (dT)磁珠，只有带poly(A)尾的mRNA才能被提取；其他不具poly(A)尾的RNA，如非编码RNA、无poly(A)尾的mRNA等不能适用本试剂盒。此外，FFPE样本中的mRNA降解严重，通常无完整的poly(A)尾结构，故亦无法使用本试剂盒进行建库。

本试剂盒所制备文库可进行多种RNA-Seq应用，包括：

基因表达（gene expression）

单核苷酸变异检测（single nucleotide variation discovery）

基因融合鉴定（gene fusion identification）

剪切变异体分析（splice variant analysis）

三、关于接头连接（Adapter Ligation）

1.本公司可提供长接头（Barcoded Adapter）试剂盒和短接头（也称为小Y接头、不完整接头）试剂盒，客户可根据实验需求进行选择。

目前有48种Indexed Adapters: Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 4（Cat#12615~Cat#12618）；双端 384 种 Index Primers: Hieff NGS^® RNA 384 CDI Primer Kit for Illumina^® , Set 1~Set 2 （Cat#12414-12415）。

2.我们建议选用高质量的商业化接头，如客户使用自制接头，请委托具有NGS引物合成经验的公司，并备注需进行严格的防污染控制。此外，进行接头退火操作时，请在超净台完成。每次只操作一种接头，防止交叉污染。

3.使用接头时，请提前将接头取出放在4°C或冰盒上解冻；在室温操作时，实验室温度最好不要超过25°C，防止接头解链。

4.建库过程中，接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中，所加入的接头体积固定为5 μL，请根据初始的RNA投入量，参考表1对接头进行稀释。接头稀释液请选择0.1×TE buffer，稀释过的接头可在4°C保存48小时。

表1 Input Total RNA量与接头浓度推荐表

四、关于磁珠纯化与分选（Bead-based Clean Up and Size Selection）

1.建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠，我们推荐使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure^® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。

2.磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。

3.磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

4.转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。

5.磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

6.产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

7.DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4°C可保存2天，-20°C可保存1个月。

五、关于文库扩增（Library Amplification）

1.本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所组成，在第一代的基础上，大大增强了扩增的均一性，即使是低拷贝的基因，也能进行无偏好性地扩增。

2.如果您使用Indexed Adapter（也称为长接头、大Y接头），可使用本试剂盒提供的引物Primer mix进行扩增；如果使用的是“短接头”或者叫“小Y接头”，则需要使用index primers进行扩增，加上相应的barcodes。

3.文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒进行文库扩增，Input Total RNA量与相应扩增循环数的推荐。

表 2 Input Total RNA 量与扩增循环数推荐表*