生物在线 - 让科研更便捷 :生命科学专业网,试剂,仪器,抗体,耗材在线查询

Hieff NGS® Universal Library Convert Kit翌圣生物科技(上海)股份有限公司

银牌供应商

性能参数

产品名称: Hieff NGS® Universal Library Convert Kit
英文名称: Hieff NGS® Universal Library Convert Kit
产品货号: 13342ES16
产品规格: 16 T
产品产地: Yeasen
产品商标: Yeasen
价    格: 询价
保存与运输: 干冰运输,-20℃保存
现货状态: 现货
产品资料: 资料下载
更新时间: 2021/7/4 16:35:00
浏览人数:14
诚信指数:1199点
了解更多:进入公司展台
使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
点此求购
在线QQ: 我是2694086042,请问我有什么可以帮到您呢?
生物在线声明:以上所展示的信息由企业自行提供,内容的真实性、准确性和合法性由发布企业负责。生物在线对此不承担任何保证责任。

供应商联系卡

翌圣生物科技(上海)股份有限公司
地址:
上海市浦东新区天雄路166弄一号楼三层南单元
邮编:
200030
电话:
400-6111-883、021-34615995-8075
传真:
021-34615995-188
联系人:
李自转
所在区域:
上海·浦东新区
邮件:
公司展台:
在线QQ:
我是2694086042,请问我有什么可以帮到您呢?
扫一扫,关注我们

产品详细描述

 产品信息

产品名称

产品编号

规格

Hieff NGS® Universal Library Convert Kit

13342ES16

16 T

13342ES96

96 T

产品描述


该试剂盒可以将
Illumina试剂盒构建的双链线性文库转化为兼容华大智造测序平台的环状ssDNA文库。构建的文库可使用BGISEQ-500RSMGISEQ-200RS MGISEQ-2000RS 进行测序。
产品组分

组分编号与名称

ES16

ES96

13342-A

 

AC-PCR Amplification mix

400 μL

1200 μL 

13342-B

 

AC-PCR Primer mix

16 μL

96 μL

13342-C

   

App-A Splint Buffer

240 μL

2×720 μL

13342-D

   

Ligase

80 μL

480 μL

13342-E

 

Digestion Buffer

130 μL

780 μL

13342-F

 

Digestion Enzyme

32 μL

192 μL

运输与保存方法

干冰运输。

所有组分-20°C保存,有效期1年。

*当运输条件、储存条件及使用方式都正确时,所有组分在有效期内均能保持完整活性。

注意事项

一、关于操作

1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。

3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡,剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

4. 为避免样品交叉污染,推荐使用带滤芯的枪头,吸取不同样品时请更换枪头。

5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

6. 定时对各实验区域进行清洁(使用0.5%次**钠或10%漂白剂进行擦拭清理),以保证实验环境的洁净度。

二、样本要求及处理

2.1样本要求

1. 样本为线性dsDNA文库,接头序列符合下列之一:

index

5-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-Insert-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-[i7]-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3

 

index

5-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-insert-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-[i7]-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3

2. 线性dsDNA文库插入片段范围为 100 ~ 500 bp,同时主带集中在±100 bp 以内。

2.2 样本量要求

 根据文库总量选择合适的线性dsDNA投入量,详见表1

1  线性dsDNA总量与浓度要求

线性dsDNA文库投入量(ng)

线性dsDNA文库总量(ng)

线性dsDNA文库浓度要求(ng/μl)

10

25

0.45

25

25<文库总量<50

1<文库浓度<2.1

50

50

2.1

2.3 转换PCR

不同线性 dsDNA 文库投入量,所需 PCR 循环也不相同,详见表2

2  不同线性dsDNA投入量PCR循环数推荐表

线性dsDNA文库投入量(ng)

推荐PCR循环数

10

8

25

7

50

6

2.4 转换文库pooling要求

1. 不推荐在转换PCR前对线性dsDNA进行pooling

2. 需将接头转换 PCR 产物混合测序,则 Sample Barcode Pooling 应遵循碱基平衡的原则:最佳平衡状态 ATGC 4种碱基的占比应分别为 25% ,若不能达到 25%,则要保证每个 cycle 都存在 ATGC 四种碱基序列,并且最少的碱基不应低于 12.5%,最多的碱基不应高于 62.5%

3. 不同片段长度的文库不建议 pooling 环化。

4. 若样本所需数据量相同且长度相同,则可以等量混合,每个样本所需的质量按照公式1进行计算:

公式1混合样本中单个样本所需质量的计算

单个样本所需的质量 (ng)=1 pmol Input DNA 对应的质量 (ng/混合的样本个数 N

5. 混合后接头转换 PCR 产物总量为 1 pmol,总体积最多为 40 μL文库不足则用 TE buffer补充至 40 μL

、关于磁珠纯化(Bead-based Clean Up

1. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致纯化得率下降。

2. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

3. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。

4. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥5 min

5. 单链环产物纯化保存,可使用TE Buffer洗脱,产物可于-20°C可保存1个月。

四、关于文库质检(Library Quality Analysis

1. 转换文库推荐使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA Assay Kit 等双链 DNA 进行定量, 要求最终接头转换 PCR产物的摩尔产量至少为 1 pmol可根据公式2计算或参考表2

 

公式2 PCR 产物摩尔数与质量间的换算

1 pmol PCR 产物对应的质量 (ng)=DNA 主片段大小 (bp)×0.66

3  不同片段大小PCR产物1 pmol对应产量

PCR产物主片段大小(bp

1 pmol对应产量(ng

300

198

350

231

400

264

450

297

500

330

2. 单链环产物纯化后推荐使用 Qubit® ssDNA Assay Kit 单链 DNA 荧光染料试剂对纯化后产物进行定量。  
3. 单链环状 DNA 产物纯化后产量应达到 60 fmol 以上方足够一次上机测序的量可根据公式3计算或参考表3 

公式 3 单链环摩尔数与质量间的换算
60 fmol 单链环对应的质量 (ng)=0.06×DNA 主片段大小 (bp)×0.33

4  不同PCR产物片段大小对应60 fmol单链环产量

PCR产物主片段大小(bp

60 fmol对应产量(ng

300

5.94

350

6.93

400

7.92

450

8.91

500

9.90

使用方法

一、自备材料

1. 纯化磁珠:Cat#12601Hieff NGS® DNA Selection BeadsCat#A63880AMPure XP Beads或其他等效产品。

2. 文库质控:Cat#12640dsDNA HS Assay Kit for Qubit®Cat#126421×dsDNA HS Assay kit for Qubit®或其他等效产品。

3. 单链环质控:Cat # Q10212, Thermo fisher Qubit® ssDNA Assay Kit或其他等效产品。

3. 其他材料:无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer10 mM Tris-HClpH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA)、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。

 

二、操作流程

1  通用文库转换流程

三、操作步骤

Part A接头转换PCR

1、转换PCR

该步骤对线性dsDNA文库进行转换-转化为可以进行后续环化的线性dsDNA文库

1. 将表5中试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。

2. 于无菌PCR管中配制表5所示反应体系。

5  转换PCR扩增反应体系

名称

体积(μL

AC-PCR Amplification Mix

25

AC-PCR Primer Mix 

1

线性dsDNA 文库

 

ddH2O

 

Total

50

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

4. PCR管置于PCR仪中,设置表6所示反应程序,进行PCR扩增

6  PCR扩增反应程序

温度

时间

循环数

98°C

1 min

1

98°C

10 sec

参照注意事项中表2

60°C

30 sec

72°C

30 sec

72°C

5 min

1

4°C

Hold

-

2转换PCR产物纯化

1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads0.9×Beads : DNA=0.9:1)至Adapter Ligation产物中,室温孵育5 min

4. PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

8. PCR管从磁力架中取出,进行洗脱:加入32 μL TE buffer,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min

9. PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约5 min),小心转移30 μL上清至干净的管中。

3转换PCR产物质检

使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit 等转换PCR产物进行定量,具体请参见注意事项四。

Part B 转换文库环化

1 变性

1. 根据文库长度,取1 pmol 0.2 ml PCR 管中,用 TE Buffer 补充至总体积 40 μL

4. 混匀后,在 PCR 仪上进行 98℃变性 3 min,之后立即置于冰上,冰浴 2 min 后瞬时离心。

2 单链环化

1. 将表7中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

2. 冰上配制表7反应体系。

7  单链环化体系

名称

体积(μL

上一步反应物

40

App-A Splint Buffer

15

Ligase

5

Total

60

3.使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底

4. PCR管置于PCR仪上,按照表8所示摄制反应程序,进行单链环化反应。

8  单链环化反应程序

温度

时间

热盖105°C

OFF

37°C

15 min

4°C

Hold

3 酶切消化

1. 将表9中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

2. 冰上配制表9所示反应体系。

9 酶切消化体系

名称

体积(μL

上一步反应物

60

Digestion Buffer

8

Digestion Enzyme

2

Total

70

3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底

4. PCR管置于PCR仪上,按照表10的条件进行反应:

10  酶切消化反应程序

温度

时间

热盖105°C

OFF

37°C

10 min

4°C

Hold

5. 反应结束后,瞬时离心,立即进行纯化

4 消化产物纯化

该步骤使用磁珠对3.3步骤的产物进行纯化。

1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads Beckman AMPure XP Beads由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取120 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads消化产物中,室温孵育10min

4. PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约2 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入500μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂。

8. PCR管从磁力架中取出,加入22 μL TE Buffer,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置10 min

9. 短暂离心,将 PCR 管始终置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约 2min),将上清小心移至新 PCR 管中, -20℃保存,待制备 DNB

5 消化产物质控

使用Qubit® ssDNA Assay Kit荧光试剂对酶切消化产物进行定量,具体请参见注意事项四。 

 

 

 

 

HB210630

生物在线声明:以上所展示的信息由企业自行提供,内容的真实性、准确性和合法性由发布企业负责。生物在线对此不承担任何保证责任。

查看 Hieff NGS® Universal Library ... 产品的用户还对以下产品感兴趣

  Hieff NGS® Universal Library Convert Kit  [供应商:翌圣生物科技(上海)股份有限公司]
  Natural Product Library | natural compound library  [供应商:MedChemExpress LLC]
  Tubulin Library | MCE  [供应商:MedChemExpress LLC]
  Specs HTS Compounds Library | MCE  [供应商:MedChemExpress LLC]
  Serine Hydrolase Library | MCE  [供应商:MedChemExpress LLC]
  RNA Library | MCE  [供应商:MedChemExpress LLC]
  Protein-Protein Interaction Library | MCE  [供应商:MedChemExpress LLC]
  Protein Mimetics Library | MCE  [供应商:MedChemExpress LLC]
  Nucleoside Mimetics Library | MCE  [供应商:MedChemExpress LLC]
  Molecular Chaperones Library | MCE  [供应商:MedChemExpress LLC]

ADVERTISEMENT

找不到您所需的产品,发布求购试试?

标题:*
描述:
姓名:*
Email:*
单位:*
电话:*
地址:*
邮编:
资料: 需要 不需要
报价: 需要 不需要