第二代耐热逆转录酶上海钰博生物科技有限公司

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性能参数

产品名称: 第二代耐热逆转录酶
英文名称: Hieff™ II Reverse Transcriptase
产品货号: 11106YB84
产品规格: 2000U
试剂级别: 分子生物学级
产品产地: 中国/美国
产品商标: 钰博生物/Ybscience
价    格: 询价
保存与运输: RT,避光
现货状态: 80
产品资料: 实验方法技术资料
更新时间: 2019/7/2 11:47:00
浏览人数:371
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产品详细描述

 第二代耐热逆转录酶

产品信息

产品名称          

产品编号

规格

储存

价格(元)

HieffTM II Reverse Transcriptase 第二代耐热逆转录酶

11106YB84

2000U

-20 ºC

 

HieffTM II Reverse Transcriptase 第二代耐热逆转录酶

11106YB92

10000U

-20 ºC

 

 第二代耐热逆转录酶产品描述

HieffTM II Reverse Transcriptase(第二代耐热逆转录酶)是HieffTM I Reverse Transcriptase(第一代耐热逆转录)的升级产品,是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基础上通过体外分子进化技术获得的全新耐热逆转录酶。与上一代相比,HieffTM II进一步大幅提高了热稳定性,50℃下半衰期超过240min,并长时间耐受55℃高温且保持稳定,非常适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。此外,HieffTM II增加了多个突变位点,进一步增强了模板亲和力和行进性,大幅提升全长cDNA的合成能力,可获得长达20 kbcDNA。另外,HieffTM II对于常见的逆转录抑制物具有更高的耐受度,非常适合于植物组织RNA的逆转录反应。

产品组分

编号

组分

产品编号/规格

1110684 (2,000U)

1110692 (10,000U)

11106-A

5×HieffTM II Reaction Buffer

100 μl

100 μl×5

11106-B

HieffTM II Reverse Transcriptase (200 U/μl)

10 μl

50 μl

 第二代耐热逆转录酶活性定义

Poly(rA) Oligo(dT)为模板/引物,在3710min内,掺入1 nmoldTTP为酸不性溶物质所需要酶量定义为1个活性单位(U)。  

运输与保存方法

冰袋(wet ice)运输。收到产品后放到-20 ºC保存。

质量控制

核酸外切酶残留检测:200 U本品和0.6 μg λ-Hind 37 ºC下孵育1hDNA的电泳谱带不发生变化。

核酸内切酶残留检测:200 U本品和0.6 μg Supercoiled pBR322 DNA37 ºC下孵育1hDNA的电泳谱带不发生变化。

RNase残留检测:200 U本品1 μg小鼠肝脏总RNA37 ºC下孵育1hRNA电泳谱带不发生变化。

功能检测1逆转录体系中加入200 U本品,以100 pg Hela cell total RNA为模板,Oligo(dT)23为引物,50 ºC反应30min。取10% cDNA产物进行PCR扩增β-actin基因。琼脂糖凝胶电泳,EB染色,可见有单一的550 bp条带。

功能检测2逆转录体系中加入200 U本品,以500 ng Hela cell total RNA为模板,Oligo(dT)23为引物,55 ºC反应45min。取10% cDNA产物进行PCR扩增Polε基因。琼脂糖凝胶电泳,EB染色,可见有单一的4.8 kb (GC-rich)条带。

功能检测3逆转录体系中加入200 U本品,以1 pg-1 μg Hela cell total RNA为模板,Oligo(dT)23VNRandom Hexamers为引物,测试qRT-PCR 性能。以6个数量级的模板量的对数值对Ct值做标准曲线,R2>0.990,斜率在-3.20-3.60之间。

 第二代耐热逆转录酶准备工作

1. 防止RNase污染:

请保持实验区域洁净;操作时需穿戴干净的手套、口罩;实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证RNase free

2. 引物选择:

2.1 后续实验为PCR

a, 如果模板为真核生物来源,一般情况下首选Oligo dT18,与真核生物mRNA3’Poly A尾配对,可获得最高产量的全长cDNA

b, 基因特异性引物 (GSP)的特异性最高。但有些情况下,用于PCR反应的GSP无法有效引导第一链cDNA合成。这时,可改用Oligo dT18Random hexamers重新进行逆转录。

c, Random hexamers特异性最低,所有RNA,包括mRNA, rRNA, tRNA均可以作为Random hexamers的模板。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高,或者模板为原核生物来源,使用Oligo dT18或基因特异性引物 (GSP)无法有效引导cDNA合成时,可使用Random hexamers为引物。

2.2 后续实验为qPCR

a, Oligo dT18Random hexamers混合使用,可使mRNA的各个区域均能以相同效率引发cDNA合成,有助于提高定量结果的重复性。

应用实例

1. 后续实验为PCR

1.1 RNA模板变性

注意】:RNA模板变性有助于打开二级结构,可在很大程度上提高第一链cDNA的产量。对于长度超过3 kbcDNA片段,请务必进行此步操作。

RNase free离心管中配制如下混合液【表1】,65 加热5 min,迅速置于冰上骤冷,并在冰上静置2 min

模板RNA变性混合体系

RNase free ddH2O

to 13 μl

Oligo(dT)18(50 μM)

or Random hexamers(50 ng/μl)

or Gene Speicific Primers(1 μM)

1 μl

模板RNA

Total RNA:100 pg-5μg;

Poly(A)+ RNA:10 pg-500 ng

1.2第一链cDNA合成体系

RNase free离心管中配制如下混合液【表2】:

第一链cDNA合成反应体系

上一步的模板RNA变性混合体系

13 μl

5×HieffTM II Reaction Buffer

4 μl

dNTP Mixture(10 mM each)

1 μl

RNase inhibitor (40 U/μl)

1 μl

HieffTM II Reverse Transcriptase(200 U/μl)

1 μl

1.3 第一链cDNA合成反应条件【表3

3 cDNA合成反应条件

25*

5 min

50**

45 min

85***

5 min

[*]: 仅当使用Random hexamers时需要此步骤;使用Oligo dT18Gene Specific Primer时省略此步骤。

[**]: 如果模板具有复杂二级结构,可将反应温度提高至55,有助于提高产量。

[***]:85 5 min为逆转录酶灭活步骤。

得到的第一链cDNA反应产物可立即用于PCR反应,或在-20保存,并在半年内使用;长期存放建议分装后在-80保存。cDNA应避免反复冻融。

2. 后续实验为qPCR

2.1 第一链cDNA合成体系

RNase free离心管中配制如下混合液【表4】:

第一链cDNA合成反应体系(For qPCR

RNase free ddH2O

to 20 μl

5×HieffTM II Reaction Buffer

4 μl

dNTP Mixture(10 mM each)

1 μl

RNase inhibitor (40 U/μl)

1 μl

HieffTM II Reverse Transcriptase(200 U/μl)

1 μl

Oligo(dT)18(50 μM)

1 μl

Random hexamers* (50 ng/μl)   

1 μl

模板RNA

Total RNA:10 pg-1μg;

Poly(A)+ RNA:10 pg-100 ng

2.2第一链cDNA合成反应条件【表5

5 cDNA合成反应条件

25

5 min

42

15 min

85

5 min

得到的第一链cDNA反应产物可立即用于qPCR反应,或在-20保存,并在半年内使用;长期存放建议分装后在-80保存。cDNA应避免反复冻融。

注意事项

 

为了您的健康,实验操作时请穿实验服和带一次性手套。

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