革兰氏阳性菌基因组 DNA 提取试剂盒
货号：D1650
规格：50T/ 100T
保存：室温(15℃-25℃) 干燥保存，复检期 12 个月，2℃-8℃保存时间更长。
试剂盒内容： D1650-50T D1650-100T
溶菌酶 0.3g 0.5g
RNase A 1m1 1m1×2
蛋白酶 K 1ml 1m1×2
溶液 A 10ml 20ml
溶液 B 10ml 20ml
漂洗液 15m1 15ml×2
洗脱液 15m1 30m1
吸附柱 50 个 100 个
收集管 50 个 100 个
说明书 1 份 1 份
产品简介：
本试剂盒采用可以特异性结合 DNA 的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，提取革兰氏阳性菌基因组 DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新型材料，能够高效专一吸附 DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组 DNA 片段大，纯度高，质量稳定可靠。使用本试剂盒提取的基因组 DNA 可用于各种常规操作，包括酶切、 PCR、文库构建、Southern 杂交等实验。
操作步骤：
使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。 所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。
1. 取细菌培养液 1ml，12000rpm 离心 1min.，尽量吸除上清。
2. 向菌体中加入 200ul 终浓度为 20mg/ml 的溶菌酶，用溶菌酶干粉加入缓冲液 20 mM Tris, pH 8.0；2 mMNa2-EDTA；1.2% Triton X-100，37 ℃处理 30 min 以上。（如果需要去除 RNA，可加入 20ul RNase A（10 mg/ml）
溶液）
3. （可选作）向上述溶液中加入 200ul 溶液 A，振荡或用移液器吹打使菌体充分悬浮，室温放置 30min-60min。
4. 向管中加入 20ul 的蛋白酶 K (10mg/ml)，充分混匀，55℃消化 30-60min，消化期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全为止，此时可见菌液呈清亮粘稠状。
5. 向管中加入 200ul 溶液 B，充分颠倒混匀，如出现白色沉淀，可于 75℃放置 15-30min，沉淀即会消失，不影响后续实验。如果溶液未变清亮，说明样品消化不彻底，可能会导致 DNA 的提取量以及纯度降低，还可能堵塞吸附柱。
6. 向管中加入 200ul 无水乙醇，充分混匀，此时还可能会出现絮状沉淀，不影响 DNA 的提取，可将溶液和絮状沉淀都加入到吸附柱中，静置 2min。
7. 12000rpm 离心 2min. 弃废液，将吸附柱放入收集管中。
8. 向吸附柱中加入 600ul 漂洗液(使用前请先检查是否己加入无水乙醇)。12000rpm 离心 1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
9. 向吸附柱中加入 600ul 漂洗液， 12000rpm 离心 l min， 弃废液，将吸附柱放入收集管中。
10. 12000rpm 离心 2min，将吸附柱敞口置于室温或 50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续实验如酶切、PCR 等。
11. 将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加 50-200ul 经 65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000rpm 离心 1min。
12. 离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置 2min ，12000rpm 离心 2 min，即可得到高质量的细菌基因组 DNA
注意事项:
1. 样品应避免反复冻融，否则会导致提取的 DNA 片段较小且提取量下降。
2. 若试剂盒中的溶液出现沉淀，可在 65℃水浴中重新溶解后再使用，不影响提取效果。
3. 如果实验中的离心步骤出现柱子堵塞的情况，可适当延长离心时间。
4. 洗脱缓冲液的体积最好不少于 50ul，体积过小会影响回收效率；洗脱液的 pH 值对洗脱效率也有影响，若需要用水做洗脱液应保证其 pH 值在 8.0 左右(可用 NaOH 将水的 pH 值调至此范围)， pH 值低于 7. 0 会降低洗脱效率。DNA 产物应保存在-20℃，以防 DNA 降解。
5. DNA 浓度及纯度检测：得到的基因组 DNA 片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。回收得到的 DNA 片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。DNA 应在 OD260处有显著吸收峰，OD260 值为 1.0 相当于大约 50μg/ml 双链 DNA、40μg/ml 单链 DNA。OD260/0D280比值应为 1.7-1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，比值会偏低，因为 pH 值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。
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