产品说明：

细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒(Hoechst Staining Kit)是一种采用经典的Hoechst33258进行细胞凋亡检测的快速简便的试剂盒。当细胞发生凋亡时，染色质会固缩，Hoechst33258染色后在荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，颜色有些发白。Hoechst Staining Kit经常用于培养的贴壁或悬浮细胞以及组织切片的细胞凋亡检测。该试剂盒检测细胞含量范围一般为0.1～1×106之间。

自备材料：

1、 可观察蓝光的荧光显微镜或激光共聚焦显微镜

2、 PBS或生理盐水

3、 载玻片、盖玻片

4、 预冷固定液：预冷的70%乙醇或4%多聚甲醛

操作步骤(仅供参考)：

(一) 贴壁细胞

1、取洁净盖玻片在70%乙醇中浸泡5min或更长时间，无菌超净台内吹干或用无菌的PBS或生理盐水洗涤3次，再用细胞培养液洗涤1次。将盖玻片置于6孔板或其他培养皿内，接种细胞培养过夜，使融合率约为50%～80%。

2、加入干预条件使细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入Hoechst固定液0.5ml，固定10min或更长时间(可4℃过夜)。

3、去除固定液，用PBS或生理盐水洗2次，每次3min，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动。

4、加入Hoechst 33258染色液0.5ml，孵育5min。也宜用摇床，或手动晃动数次。

5、弃染色液，用PBS或生理盐水洗2次，每次3min，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动。

6、滴一滴抗荧封片剂于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片剂，尽量避免气泡。

7、荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长350nm左右，发射波长460nm左右。

(二)悬浮细胞

1、离心收集细胞样品于1.5ml离心管内并弃液，加入Hoechst固定液0.5ml，缓缓悬起细胞，固定10min或更长时间(亦可4℃过夜)。

2、低速离心去除固定液，用PBS或生理盐水洗2次，每次3min。洗涤时手动晃动数次。

3、低速离心离心后吸去大部分液体保留约50μl液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。

4、稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。

5、滴加Hoechst 33258染色液0.5ml，孵育5min。用吸水纸从边缘吸去液体，微晾干。

6、弃染色液，用PBS或生理盐水洗2次，每次3min，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动。

7、滴一滴抗荧光封片剂于载玻片上，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。

8、荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长350nm左右，发射波长460nm左右。

(三)组织切片

1、常规包埋切片。

2、用PBS或生理盐水洗2次，每次3min。洗涤时手动晃动数次。

3、均匀滴上Hoechst 33258染色液0.5ml，孵育5分钟。

4、弃染色液，用PBS或生理盐水洗2次，每次3min，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动。

5、 将切片置于载玻片上，滴一滴抗荧光封片剂，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。

6、荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长350nm左右，发射波长460nm左右。

注意事项：

1、 荧光染料都存在淬灭的问题，建议染色后尽快检测。使用抗荧封片剂时也应避光操作。

2、 在为了获得细胞沉淀的离心的过程中，对于特殊细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当提高离心力或延长离心时间。

3、 Hoechst 33258染色液对人体有一定刺激性，请注意适当防护。

4、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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